背景:哺乳动物的心脏在受到生理或病理刺激后,心脏稳态被破坏,心脏的组织和结构发生病理性变化;然而,这背后的潜在MRTX849分子量机制仍不完全清楚。N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)甲基化是哺乳动物mRNA中最常见的内部修饰之一,而肾母细胞瘤 1-相关蛋白(Wilms’tumor 1-associatingprotein,WTAP)是 RNA m6A 甲基转移酶复合物的关键调控酶。我们之前的研究结果显示,心肌特异性敲除WTAP导致小鼠的心功能显著下降,左心室严重扩张,且无法代偿性肥厚;在体外培养的心肌细胞中敲低WTAP的表达,细胞无法响应苯丙肾上腺素刺激而肥厚,而过表达WTAP则使心肌细胞进行肥大性增长;但是具体调控机制尚未研究。在本研究中,我们探讨了 WTAP介导的m6A修饰在心脏稳态中重要作用及分子机制。方法:采用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)和western blot分别检测RNA和蛋白质的表达。使用m6A甲基化定量试剂盒检测总RNA的m6A甲基化水平。通过甲基化RNA免疫沉淀(methylated RNA immunoprecipitation,MeRIP)后的高通量测序以及 RNA 测序(RNA-seq)绘制敲除WTAP的小鼠心脏m6A修饰谱和表达谱,并对差异表达或甲基化下调的基因进行功能分析。利用多组学交叉分析鉴定WTAP的下游靶点,并通过MeRIP-qPCR和 qPCR 进行验证。利用 RNA 免疫沉淀(RNA immunoprecipitation,RIP)-qPCR 检测WTAP与靶基因转录本之间的相互作用。通过小干扰RNA和腺病毒在体外培养的心肌细胞或HEK293细胞中敲低或过表达WTAP。通过双荧光素酶报告系统和RNA稳定性分析,揭示WTAP如何调控肌球蛋白轻链激酶家族成员4(myosin light chain kinase family member 4,Mylk4)mRNAAs remediation 水平。通过腺相关病毒血清 9 型(AAV9)在小鼠心脏中过表达WTAP和MYLK4以研究其对心脏稳态的影响。使用超声心动仪检测小鼠的心脏功能和结构的变化。采用小麦胚芽凝集素和Masson染色分别检测心肌截细胞面积和心肌纤维化程度。结果:我们发现肥厚型心肌病患者心肌组织和压力超负荷导致的小鼠肥厚心肌组织中RNA m6A甲基化水平和WTAP蛋白表达均降低。对WTAP敲除和对照小鼠进行MeRIP-seq和RNA-seq联合分析,并结合以往描绘的肥厚型心肌病患者以及压力超负荷小鼠心肌组织中表达变化的基因,我们鉴定出5个WTAP的潜在下游靶点。MeRIP-qPCR和qPCR分析表明敲除WTAP后Mylk4甲基化降低,Mylk4 mRNA水平降低。RIP-qPCR分析表明在小鼠心脏中WTAP和Mylk4 mRNA存在相互作用。双荧光素酶报告实验分析显示,抑制WTAP以m6A依赖的方式降低Mylk4的表达。RNA稳定性分析提示,抑制WTAP降低Mylk4 mRNA的稳定性,从而导致Mylk4表达下调。Western blot表明敲除WTAP后MYLK4蛋白水平显著降低,MYLK4的作用底物肌球蛋白轻链2-Ser15磷酸化显著降低,提示WTAP调控MYLK4的表达。心脏过表达MYLK4可以部分缓解WTAP缺失引起的心功能障碍。最后,WTAP的过表达促进了心肌肥厚,并加重横主动脉弓缩窄引起的心肌重构和心功能障碍。结论:我们的研究表明WTAP是心脏稳态的关键调节因子,WTAP介导的Mylk4 m6A修饰在调控心肌重构和维持心脏稳态中具有重要作用,而且MYLK4可能是治疗病理性心肌重构的潜在靶点。背景:长链非编码RNA(long noncodiFG-4592 NMRng RNAs,lncRNAs)已经成为各种生物过程的关键调控因子。然而,lncRNAs在心肌纤维化中的调控机制尚未完全阐明。本研究旨在分析人心脏成纤维细胞(human cardiac fibroblasts,HCFs)中lncRNAs的表达模式并进行功能分析。方法:我们使用转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)处理HCFs以诱导其活化和表型转化。然后,进行链特异性RNA测序,对lncRNAs进行定量和分类,并在HCFs中进行功能分析。我们用分子和细胞生物学的方法研究HCFs的表型转化。结果:在所有已鉴定的候选lncRNAs中,TGF-β刺激的HCFs中分别有176个和526个lncRNAs表达上调和下调。功能分析显示,差异表达lncRNAs的靶基因主要与局部粘附、代谢通路、Hippo信号通路、PI3K-Akt信号通路、肌动蛋白细胞骨架调控和肥厚型心肌病有关。此外,lncRNAs NONHSAG005537和NONHSAG017620抑制了 TGF-β诱导的HCFs的增殖、迁移、侵袭和转化。结论:我们绘制了 lncRNAs在心肌纤维化中的表达谱,并表明了 NONHSAG005537和NONHSAG017620在心脏成纤维细胞激活过程中的抑制作用,为抗纤维化治疗提供了一个很有前途的靶点。