研究背景神经母细胞瘤(Neuroblastoma,NB)起源于原始神经脊细胞,是最常见的儿童颅外恶性实体肿瘤。临床异质性显著,极低危组患者无需治疗,肿瘤可自发消退;高危组尽管采用化疗、手术、放疗、外周血干细胞移植以及免疫治疗等强化综合治疗,仍存在疾病进展及复发,死亡率达40%。深入研究NB发生及分化机制,寻找新治疗靶点,对于提高患者预后具有重要意义。研究表明,Thyroid Transcription Factor 1(TTF1)是调控神经分化的重要转录因子,可以促进神经干细胞分化;通过与其他转录因子相互作用,启动下游基因表达,从而调节神经分化相关基因表达。TTF1在多种肿瘤的发生及分化中起调控作用。目前,TTF1在NB发生的作用和机制尚未见报道。研究目的本文旨在阐明TTF1抑制NB细胞恶性生物学行为和调控分化的作用及机制,为NB的治疗提供潜在的靶点及理论依据。研究方法1、收集9例不同分化程度NB组织(神经节细胞瘤(GN)、分化型NB和未分化型NB),RNA测序鉴定肿瘤组织中差异表达基因(DEGs)和miRNA,对DEGs 进行 GO(Gene Ontology)和 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析;分析 TTF1 及下游 TrkA、miR-204 和 TrKB 表达,Real time PCR进行验证。2、生物信息学分析、荧光素酶报告、RIP(RNA immunoprecipitation)实验预测并验证TTF1、TrkA、miR-204和TrkB之间的相互调控关系。收集另外60例不同分化程度NB组织,免疫组化(IHC)染色、FISH原位杂交、PCR和Western blot(WB)验证TTF1、TrkA、miR-204和TrkB在NB组织表达水平及相关性。3、构建TTF1过表达和低表达NB细胞,PCRTransmembrane Transporters抑制剂和WB检测TTF1、TrkA、miR-204和TrkB表达水平。CCK8实验、EdU实验、克隆形成实验、细胞凋亡流式检测、细胞周期分析、划痕实验和Transwell实验验证TTF1对NB细胞增殖、迁移、侵袭及抗凋亡能力等恶性生物学行为的影响。4、在TTF1过表达NB细胞中,抑制miR-204、沉默TrkA或过表达TrkB。克隆形成实验、EdU实验、划痕实验、Transwell实验、凋亡细胞流式检测和细胞周期流式等实验,验证抑制miR-204、沉默TrkA或过表达TrkB是否逆转TTF1对NB细胞恶性生物学行为的影响。5、NGF(Nerve Growth Factor)预处理的TTF1过表达的NB细胞,EdU实验检测细胞增殖,infections after HSCTPCR、WB和免疫荧光检测检测神经源性分化相关分子MAP2、NSE和TAU表达水平,验证TTF1是否促进NGF介导的NB细胞分化。6、构建皮下异体移植瘤裸鼠模型,观察过表达TTF1是否抑制移植瘤生长;RT-PCR、WB和IHC染色检测肿瘤组织TTF1及其下游基因和P53表达变化;使用NGF处理移植瘤裸鼠,观察过表达TTF1是否增强NGF抑制肿瘤生长和促分化的作用。研究结果1、GO及KEGG分析提示不同分化程度NB组织的DEGs与细胞代谢、细胞周期调节、P53、PI3K等肿瘤信号通路相关;TTF1、TrkA和miR-204是不同分化NB组织中差异表达基因和miRNA。2、TrkA和miR-204是TTF1的转录下游基因,TrkB是miR-204的靶基因。TTF1、TrkA和miR-204在未分化型NB组织中表达下调,TrkB蛋白而非mRNA在未分化型NB组织中高表达。3、在NB细胞中过表达TTF1,上调TrkA mRNA表达,TrkB mRNA表达无变化。敲低TTF1下调TrkA蛋白表达,上调TrkB蛋白表达。过表达TTF1抑制NB细胞增殖、迁移和侵袭,诱发细胞凋亡和细胞周期停滞;敲低TTF1则产生相反作用。TTF1抑制NB细胞多种恶性生物学行为。4、在TTF1过表达的NB细胞中抑制miR-204,上调TrAdezmapimod IC50kB蛋白表达,促进NB细胞迁移、增殖和侵袭,促进细胞分裂周期;沉默TrkA或过表达TrkB,促进细胞增殖,减少细胞凋亡,下调促凋亡蛋白表达。抑制miR-204、沉默TrkA和过表达TrkB逆转TTF1对NB细胞多种恶性生物学行为的抑制作用。5、过表达TTF1促进NGF预处理导致的NB细胞分化,抑制细胞增殖,增加分化标记物表达。6、体内实验证实过表达TTF1抑制肿瘤生长,上调miR-204表达及TTF1、TrkA和p53蛋白表达,下调TrkB蛋白表达。TTF1过表达联合NGF处理抑制肿瘤生长,促进分化标记物MAP2、NSE和TAU表达。体内实验证实过表达TTF1抑制NB生长、促进NB分化。研究结论TTF1通过调节TrkA和miR-204/TrkB轴抑制NB细胞增殖、迁移和侵袭,导致细胞周期停滞,促进凋亡并诱导NB的神经源性分化。TTF1可能是NB治疗的潜在的靶点。