结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是常见且致死率最高的癌症之一,其发病率在中国呈逐年递增趋势,并且发病年龄越来越小。现有治疗策略有效率低、毒副作用大,并且依赖特定基因突变状态。临床上迫切需要研究结直肠癌进展的机制并开发靶向小分子药物。小泛素样修饰分子(Small ubiquitin-like modifier,SUMO)化修饰参与肿瘤信号通路调节、肿瘤干细胞更新和肿瘤发生,SUMO1是潜在的治疗靶点。通过胞内蛋白降解体系,可以使肿瘤相关蛋白成为药物靶标。我们发现靶向SUMO1的小分子降解物(Small molecular degrader of SUMO1,SMDS1)可以诱导胞浆激活/增殖相关蛋白1(Cytoplasmic activation/proliferation-associated protein 1,CAPRIN1)与F-bLY294002 IC50ox only蛋白42(F-box only protein 42,FBXO42)相互作用,募集SUMO1至E3连接酶复合物,并完成对SUMO1的降解。这一发现为结直肠癌治疗提供了新的方向。为了初步探索靶向降解SUMO1对细胞带来的变化,我们首先检索了GEO(Gene expression omnibus)公共数据库,挖掘到GSE163884数据集。该数据集的研究者使用CRISPR/Cas9技术分别敲除了人骨肉瘤U2OS细胞中SUMO1和SUMO2的表达,利用RNA-seq分析SUMO1和SUMO2敲除细胞系的转录组。然后,我们选用数据集中的对照组和SUMO1敲除组样本,将筛选出的差异表达基因进行了加权基因共表达网络分析(Weighted gene co-expression network analysis,WGCNA)、GO基因功能富集、KEGG通路富集和基因集富集分析(Gene set enrichment analysis,GSEA)。通过WGCNA分析,我们鉴别出了2个与SUMO1敲除密切OXPHOS抑制剂相关的共表达模块。对模块内特征基因进行GO/KEGG富集分析,结果显示线粒体的呼吸链传递、氧化磷酸化通路与SUMO1敲除可能有关。进一步的GSEA分析也发现氧化磷酸化通路、呼吸链电子传递在SUMO1敲除样本中呈上调趋势,而Wnt/β-catenin通路呈受抑制状态。这些信息提示我们SUMO1敲除后可能使线粒体呼吸功能受到影响,Wnt/β-catenin通路可能在其中发挥了作用。这为我们后续的实验设计提供了参考思路,并将细胞代谢指标作为研究切入点。表型研究方面,我们证明了SMDS1可在结直肠癌细胞系、小鼠移植瘤和病人来源的肿瘤异种移植模型(Patient-derived xenografts,PDX)中发挥良好的肿瘤抑制作用。结合此前生物信息学分析的提示,全基因组CRISPR/Cas9文库敲除筛选结果中出现的戊糖磷酸途径(Pentose phosphate pathway,PPP)的关键酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD)引起了我们的注意。后续实验我们发现SMDS1在不降低G6PD蛋白水平的前提下可以显著抑制其酶活性,同时使PPP主要产物还原型辅酶磷酸腺苷二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)水平明显降低。NADPH的供应对于维持脂类的正常合成非常重要。对应的,我们也观察到SMDS1抑制了CRC细胞的脂类合成。进一步检测我们发现该小分子使CRC细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)过量累积,打破了氧化应激稳态,同时导致了细胞内质网应激。另外,通过对Caspase 8活性和Annexin V信号测定,结合对移植瘤的免疫组化染色结果,我们证实小分子SMDS1并未引起CRC细胞凋亡。在进行GSE163884差异基因的GSEA分析时,我们还发现SUMO1敲除会导致DNA双链损伤修复、碱基剪切修复、DNA复制和细胞周期等通路呈现出下调趋势。而且免疫印迹实验也显示SMDS1降低了细胞周期蛋白依赖型激酶4/6(Cyclin-dependent kinases 4/6,CDK4/6)的蛋白水平。因此,我们推测小分子SMDS1通过诱导细胞周期停滞来发挥其抑制肿瘤生长的作用。我们进一步探究了SMDS1引起这些表型变化的机制。在SMDS1的全基因组CRISPR/Cas9文库敲除筛选结果中,位列第一的类固醇生成急性调控蛋白(Steroidogenic acute regulatory protein,St AR)相关脂类转运(St AR-related lipid transfer,START)结构域蛋白7(START domain containing 7,StarD7)是SMDS1发挥作用的关键。我们在CRC细胞系、3D类器官、PDX水平验证了SMDS1确实可降低StarD7蛋白水平。接下来,我们证明了StarD7与肿瘤增殖密切相关。相较于正常组织,CRC中存在着过度表达StarD7的现象。我们利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术敲除HCT116细胞系的StarD7后,其生长明显受到抑制。应用StarD7敲除细胞株建立的皮下移植瘤模型成瘤速度也显著减慢,小鼠生存期延长。另外,我们还观察到敲除StarD7基因使细胞对SMDS1抑制肿瘤生长的作用产生了抗性。在StarD7敲除细胞株中,小分子SMDS1对G6PD活性抑制作用减弱,降低NADPH和脂类合成的作用也明显减小。同时,SMDS1无法在StarD7敲除细胞株中诱发氧化应激和内质网应激。可见,该小分子依赖于StarD7发挥作用。SMDS1对StarD7的调控依赖于SUMO1降解。我们发现敲除SUMO1与SMDS1处理有着类似的细胞效应,均使得StarD7蛋白水平降低。但在SUMO1敲除的基础上,小分子SMDS1无法进一步减少StarD7表达,也无法诱导氧化应激和内质网应激。通过染色质免疫沉淀(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)实验联合聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR),我们发现转录因子T细胞因子4(T cell factor 4,TCF4)可与StarD7启动序列结合。荧光素酶报告基因实验显示小分子SMDS1极大的抑制了TCF4转录活性。SMDS1靶向降解SUMO1导致了SUMO1对于TCF4的SUMO化修饰也相应减少。这使得TCF4被定向到蛋白酶体途径进行降解,因此其转录活性受到抑制。这进而导致StarD7基因的转录水平下降,最终引起StarD7蛋白质水平的降低。我们注意到SMDS1作用后使得CRC细胞中ADP/ATP比值明显升高,意味着SMDS1诱发了细胞能量应激。AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)作为胞内能量应激的“感应器”,其具有酶活性的α亚基被激活,从而抑制了G6PD活性。使用AMPK抑制剂可逆转SMDS1对G6PD活性的抑制,但无法缓解SMDS1引起的StarD7蛋白降低。StarD7敲除可缓解SMDS1引起Pancreatic infection的能量应激。我们还证明G6PD活性降低是由于SMDS1阻止了其活性二聚体的形成。本研究中,SMDS1在结直肠癌中的作用机制可以概括如下:1.SMDS1与CAPRIN1结合,促使SUMO1的泛素化和降解;2.SUMO1水平降低导致TCF4的SUMO化修饰减弱,使TCF4经蛋白酶体降解增多,进而抑制了TCF4的转录活性;3.TCF4转录活性受到抑制,导致StarD7基因转录水平下降,从而减少StarD7蛋白质水平;4.StarD7蛋白质水平降低引发内质网应激和ROS过度累积;5.SMDS1通过减少StarD7蛋白质水平诱发细胞能量应激,并激活AMPK,这进而抑制G6PD的活性,导致细胞内NADPH水平下降,从而抑制脂肪酸合成代谢;6.NADPH的减少进一步加重了氧化应激,造成细胞周期停滞,抑制结直肠癌细胞增殖。