目的:创伤性脊髓损伤(SCI)常导致运动、感觉和自主神经功能丧失,是全世界亟待解决的重大医学难题。本研究构建了一种负载神经生长因子(NGF)的苯硼酸(PBA)修饰的树枝状大分子(PAMAM)复合纳米粒子(PPN-NPs),由于PBA对于活性氧(ROS)的响应性,该粒子能够在SCI产生的ROS微环境下分解,释放PAMAM和NGF,PAMAM通过吸附核酸碎片(NAD)和铁离子,抑制炎症反应和铁超载,NGF为内源性神经干细胞(e NSC)的神经发生提供营养,利用这种联合治疗策略促进SCI后脊髓的再生。我们深入探究了PPN-NPs对SCI大鼠的治疗效果和机制,旨在为SCI的功能恢复提供新的治疗方案。方法:本研究主要包括以下三部分工作:(1)PPN-NPs的制备和理化性能表征:将PAMAM与PBA在加热条件下共混,获得PBA修饰的PAMAM纳米粒子(PP-NPs),随后在室温下将PP-NPs与NGF共孵育,构建PPN-NPs;利用核磁共振氢谱(~1H NMR)表征PP-NPs的结构,荧光能量共振转移(FRET)实验探讨PP-NPs是否成功负载NGF;动态光散射(DLS)、电位仪和透射电镜(TEM)表征PPN-NPs的大小、ζ-电位和微观形貌;通过溴化乙锭(EB)竞争结合法检测PP-NPs吸附NAD的效率;~1H NMR和二苯基苦基苯肼(DPPH)法检测PP-NPs的ROS响应性和清除率;电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)检测PP-NPs螯合铁离子的能力。(2)体外实验评估PPN-NPs神经保护、抑制炎症反应和促神经发生的能力。通过CCK-8法检测PPN-NPs对于神经元细胞PC-12的生物相容性、氧化损伤保护能力和铁超载保护能力;免疫荧光染色法检测PPN-NPs对NAD刺激后小胶质细胞BV2极化(CD86,M1极化;CD206,M2极化)和神经干细胞NE4C分化(Tuj-1,神经元;GFAP,星形胶质细胞)情况的影响。(3)体内实验评价PPN-NPs对于SCI大鼠的治疗效果。构建挫伤型SCI大鼠模型,在损伤部位局部注射三组样品(salinProbiotic producte、PP-NPs和PPN-NPs),于术后5天通过免疫荧光染色(iba-1,活化的小胶质细胞;GFAP;Tuj-1;nestin,神经干细胞)评估纳米粒子体内早期抗炎和促e NSC神经发生的作用;连续6周,每周通过Basso,Beattie,Bresnahan(BBB)评分评估大鼠下肢运动能力,脊髓H&E和免疫荧光染色(Tuj-1&GFAP)等评价纳米粒子促进SCI大鼠运动功能和脊髓组织学恢复情况。结果:(1)成功制备PPN-NPs。电镜下粒子大小约为110 nm,水合粒径约为222.2nm,ζ电位为1.1 m V,接近电中性。前体粒子PP-NPs在纳米粒子/核酸质量比5:1时达到饱和吸附;表面修饰的PBA在100μmol/L H_2O_2环境下分解,以剂量依赖的方式清除ROS;铁离子螯合效率达88.2%。(2)CCK-8检测结果显示:PPN-NPs无明显细胞毒性;增加氧化损伤环境下PC-12的存活率(65%到90%);提高铁超载条件下PC-12的存活率(73%到89%);免疫荧光结果显示:PPN-NPs诱导NAD刺激的BV2表达M2型极化标志物CD206,促进NE4C表达神经元标记物Tuj-1。(3)SCI大鼠术后5天免疫荧光结果显示:PPN-NPs抑制ibBMS-907351核磁a-1表达,促进Tuj-1表达;BBB评分显示PPN-此网站NPs组大鼠得分明显高于PP-NPs组和saline组;术后6周的H&E及免疫荧光结果显示:相比于PP-NPs和saline组,PPN-NPs组实现更好的组织修复和神经再生。结论:本实验设计制备的PPN-NPs具有清除危险信号因子的作用,包括吸附NAD、清除ROS和螯合铁离子,可以逆转NAD介导的小胶质细胞促炎极化,促进神经干细胞向神经元分化。局部注射到损伤的脊髓后,PPN-NPs可以抑制炎症反应、增加e NSC神经发生、促进SCI大鼠的运动功能改善和组织学恢复。PPN-NPs为未来治疗SCI提供参考,同时为开发新的联合治疗策略奠定基础。