目的:在法医检案中经常遇到争吵、寒冷、轻微外伤等应激因素刺激后快速死亡的案例,部分经系统尸检无明显致死性的疾病或损伤,死亡原因常鉴定为死因不明或心源性猝死,此类案件因缺乏较为特异的病理形态学诊断指标致使鉴定意见有争议,往往启动多次重新鉴定,使案件久拖不决,造成不良社会影响。冠状动脉痉挛(Coronary artery spasm,CAS)是指局部或弥漫性冠状动脉对各类刺激的可逆性过度收缩反应,使正常或粥样硬化的冠状动脉部分或全部阻塞,可导致心肌缺血、心肌梗死甚至猝死,提示其可能是导致无明显心脏疾患心性死亡的重要机制之一;CAS亦可引起冠心病患者急性心律失常导致死亡;轻微外伤等应激因素是否通过引起CAS导致快速死亡有待证实;因此揭示CAS致死的病理分子机制是法医病理学亟待解决的科学技术问题。研究已证实血管平滑肌细胞的收缩高反应性是CAS引起血管过度收缩的主要机制。肌球蛋白轻链2(Myosin II regulatory light chain,MLC2)磷酸化是局部血管平滑肌收缩反应的关键。平滑肌收缩效率取决于收缩蛋白对钙的敏感性,PKC加强的磷酸酶抑制剂17(Protein Kinase CPotentiated Phosphatase Inhibitor 17,CPI-17)是调节钙敏感性的重要分子。CPIgenetic test-17最初被确认为PKC磷酸化底物,随后发现Rho激酶、蛋白激酶N(Proteinkinase N,PKN)、整合素连接激酶(Integrin-Linked Kinase,ILK)等也可磷酸化CPI-17。提示CPI-17极可能是细胞内多种激酶调节肌球蛋白轻链磷酸酶(Myosin light chain phosphatase,MLCP)诱导CAS的共同关键枢纽。PKC通过调节下游信号在血管收缩中起着至关重要的作用,如内皮素-1(Endothelin-1,ET-1)、丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)、CPI-17等。然而,目前尚不清楚PKC是否调节CPI-17/MLC2信号通路在CAS中发挥作用。因此本项目拟从整体动物水平、细胞水平,建立痉挛损伤模型,研究PKC/CPI-17/MLC2通路诱导CAS的作用机制,探讨该通路在冠状动脉痉挛发生中关键因子的变化。筛选可靠的CAS标记物为临床和法医学鉴定提供新思路。方法:1.整体水平研究:(1)建立冠状动脉痉挛大鼠模型。(2)实验分组为Control组和CAS组。(3)应用HE染色观察冠状动脉内弹力膜折叠程度、冠状动脉平滑肌收缩带变化。(4)采用透射电镜观察心肌的超微结构变化。(5)采用上机生化检测心肌酶水平。(6)采用Western blot法、免疫组织化学染色法和免疫组织荧光化学染色法检测PKC/CPI-17/MLC2通路相关蛋白p-CPI-17(Thr38)、CPI-17、p-MLC2(Ser19)、MLC表达情况。2.细胞水平研究:(1)体外培养人冠状动脉平滑肌细胞(h CASMCs),将血管收缩剂(血管紧张素,Ang II)以不同的剂量(0、0.05、0.1、0.5、0.1 u M/m L)或不同的时间(0、5、15、30、60 min)添加到培养液,采用Docetaxel免疫细胞荧光化学染色观察p-MLC2(Ser19)表达变化,以选择使细胞收缩的最佳Ang II浓度和时间。(2)实验分组为Veh组,Calphostin C组,GF-109203X组,Ang II组,Ang II+GF-109203X组and Ang II+Calphostin C组。(3)经免疫细胞荧光染色法检测PKC/CPI-17/MLC2通路相关蛋白PKCα、PKCδ、PKCε、p-CPI-17(Thr38)、CPI-17、p-MLC2(Ser19)、MLC表达情况。(4)加入PKC抑制剂(GF-109203X,5μmol/L;Calphostin C,3μmol/L)与对照组h CASMCs同等条件下培养相同时间后,激光共聚焦免疫荧光技术观察各组细胞内肌丝排列改变,用免疫细胞荧光染色法检测PKCα、PKCδ、PKCε、p-CPI-17(Thr38)、CPI-17、p-MLC2(Ser19)、MLC表达变化。结果:1.整体水平研究结果(1)HE染色结果表明:与对照组大鼠冠状动脉相比,CAS组大鼠冠脉平滑肌细胞空泡变,冠脉内膜折叠度增加。(2)透射电镜结果表明:与对照组大鼠心肌相比,CAS组心肌细胞线粒体肿胀,膜破损,基质部分变浅、溶解,嵴断裂、变短;肌浆网明显扩张,空泡变。(3)心肌酶检测结果表明:与对照组相比,尾静脉注射垂体后叶素2 min组CAS大鼠血清中肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)、乳酸脱氢酶同工酶(LDH1)没有明显差异;尾静脉注射垂体后叶素10 min和30 min组CAS大鼠血清中CK、CK-MB、LDH、LDH1水平升高。(4)免疫组织化学染色、免疫组织荧光化学染色和Western blot检测结果显示:与对照组相比,CAS组冠状动脉中p-CPI-17(Thr38)和pMLC2(Ser19)磷酸化水平升高。2.细胞水平研究结果(1)体外培养h CASMCs,细胞免疫荧光染色方法检测平滑肌细胞的标志性蛋白(a-SMA)表达情况。该细胞系基本具备原代培养的冠状动脉平滑肌细胞的形态学、表型及各项功能特点。(2)免疫细胞荧光化学染色结果显示:在Ang II处理期间,h CASMCs显示MLC2的磷酸化水平的增加,其在剂量为0.1μM/ml,处理时间为30min时达到最高水平,因此选择0.1μM/ml Ang II作用30 min时进行后续实验。(3)免疫细胞荧光化学染色结果显示:与对照组相比,Ang II组PKCα从h CASMCs细胞质转位至细胞膜上,而PKCδ和PKCε表达在细胞质中,与对照组相比无明显差异。(4)免疫细胞荧光化学染色结果显示:Veh组、Calphostin C组、GF-109203X和Ang II+Calphostin C组的PKCα主要位于细胞质中,Ang II组和Ang II+GF-109203X组的PKCα从细胞质转位至细胞膜上。(5)免疫细胞荧光化学染色结果显示:与Veh组相比,Calphostin C组和GF-109203X组p-CPI-17(Thr38)和p-MLCD-Lin-MC3-DMA molecular weight2(Ser19)蛋白阳性表达无显著差异;与Veh组相比,Ang II组p-CPI-17(Thr38)和p-MLC2(Ser19)蛋白阳性表达明显增高;与Ang II组相比,Ang II+GF-109203X组和Ang II+Calphostin C组p-CPI-17(Thr38)和p-MLC2(Ser19)蛋白阳性表达降低。结论:在整体水平研究中,冠状动脉痉挛组大鼠的冠状动脉中p-CPI-17(Thr38)、p-MLC2(Ser19)升高;在细胞水平研究中,Ang II组的h CASMCs中PKC-α发生移位,并且h CASMCs中p-CPI-17(Thr38)、pMLC2(Ser19)升高,提示PKC/CPI-17信号通路参与冠状动脉痉挛的发生;p-CPI-17(Thr38)、p-MLC2(Ser19)可能作为诊断死前CAS的分子标记物。