实验目的:阿霉素是临床上治疗肝癌的常见化疗药物,可改善患者的生存质量,延长患者的生存期,但耐药问题是导致化疗失败的主要原因。尽管关于阿霉素的耐药机制已经有许多研究,但目前仍然缺乏有效的方法来克服其耐药性。我们通过临床标本和细胞系发现,阿霉素可上调视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)的表达,并且肝癌对阿霉素的敏感性与Rb呈负相关,推测Rb是介导肝癌阿霉素耐药的关键因素。研究还发现阿霉素能够通过磷酸化Rb释放转录因子E2F-1,促进Siglec-15转录,但详细的分子机制尚未阐明。本课题利用临床标本、荷瘤动物模型及细胞模型等,阐明肝癌阿霉素耐药的具体分子机制,同时探讨帕博西尼与阿霉素联合应用对肝癌的治疗效果,为解决阿霉素耐药和肝癌治疗提供新的思路和策略。实验方法:1.评价阿霉素和帕博西尼的协同作用:MTT法计算阿霉素和帕寻找更多博西尼联合使用的协同指数;克隆形成实验评价阿霉素和帕博西尼合用对细胞增殖的影响;流式细胞术检测阿霉素和帕博西尼对细胞周期的影响;建立肝癌动物模型,评价阿霉素和帕博西尼在体内的协同抗肿瘤效果;病理学检测帕博西尼降低阿霉素心脏毒性的效果;生化指标分析两药联用的增效减毒的效果。2.明确Rb在促进肝癌细胞对阿霉素耐药中的作用:基于人基因表达数据集,比较Rb在正常样本和肝癌中的表达差异;收集人肝癌细胞系,比较Rb的表达与肝癌细胞对阿霉素敏感性的差异;MTT和克隆history of forensic medicine形成实验检测敲低/过表达Rb后肝癌细胞对阿霉素敏感性的变化;构建小鼠皮下瘤模型,使用帕博西尼作为工具药,体内验证Rb在促进阿霉素耐药中的作用。3.阐明阿霉素通过Rb调控Siglec-15介导肿瘤免疫逃逸的分子机制:Western blot和Real time PCR实验检测阿霉素对Rb和Siglec-15蛋白及mRNA的影响;免疫荧光和Co-IP实验证明阿霉素对Rb和E2F-1相互作用的影响;ChIP实验和双荧光素酶报告基因实验明确E2F-1对Siglec-15的调控作用;流式细胞术评价阿霉素对小鼠肿瘤组织中CD8~+www.selleck.cn/products/PD-0332991T细胞的作用;酶联免疫吸附实验检测阿霉素对小鼠血清中免疫相关指标的影响;收集肝癌患者临床样本,验证Rb和Siglec-15与肝癌发生的关系,明确Siglec-15的免疫抑制作用。实验结果:1.体内和体外实验表明阿霉素与帕博西尼联用后具有很好的协同抗肿瘤效果,同时帕博西尼能够明显减轻阿霉素所导致的心脏毒性。2.成功构建HepG2/Dox耐药细胞株,并且结果显示,与敏感株相比,HepG2耐药株中Rb被异常激活,同时Rb的表达与肝癌细胞阿霉素敏感性呈负相关,过表达Rb之后肝癌细胞对阿霉素的敏感性降低,使用帕博西尼后能够增加阿霉素对肝癌细胞的抑制作用。这些结果表明,Rb是导致肝癌细胞阿霉素耐药的关键因素。3.临床标本和数据集显示,与正常组织相比,Rb与Siglec-15在肝癌中表达上调,相关性分析表明二者呈显著正相关,与肝癌患者的预后呈负相关;阿霉素孵育肝癌细胞24h后明显降低了Rb和E2F-1之间的相互作用,促进了E2F-1的释放;双荧光素酶报告基因结果显示,E2F-1能够增加Siglec-15启动子活性;肝癌动物模型结果表明,阿霉素治疗组小鼠肿瘤内CD8~+T细胞数目明显受到抑制,这些结果显示阿霉素能够通过Rb/E2F通路调控Siglec-15表达,抑制CD8~+T细胞活性。实验结论:帕博西尼与阿霉素联用后能够明显逆转肝癌细胞对阿霉素的耐药作用。