S6 kinase 信号通路

线粒体作为细胞的重要能量来源,其数量、质量及功能的稳定对维持细胞的正常活动至关重要,且其稳态C59分子式的调节依赖于线粒体质量控制系统(包括线粒体自噬、线粒体融合/分裂及线粒体生物合成等)。SARS-CoV2 virus infection线粒体蛋白ATP合酶抑制因子1(ATP synthase inhibitor 1, IF1)是线粒体基质中抑制F1FoATP酶/合酶活性的天然小分子蛋白质。在细胞缺氧缺血等特殊生理情况下, IF1通过改变自身的聚合状态,抑制F1FoATP酶水解ATP的活性,从而抑制细胞内的ATP被过度水解。最近的研究证实, IF1的抑制作用是双向的,其即可抑制F1FoATP酶活性,又可抑制F1FoATP合酶Roxadustat IC50活性。因此, IF1可通过靶向F1FoATP酶/合酶活性及相关信号通路,参与调节线粒体质量,维持线粒体稳态。该文综述IF1在线粒体质量控制中的相关调节机制,包括IF1维持线粒体氧化还原平衡、IF1介导线粒体自噬、IF1促进线粒体融合/分裂三条通路,以及三者之间相互作用的关系,为探索IF1在相关疾病的发生、发展及治疗中的作用提供理论参考。

目的 探讨雄激素受体(AR)、肿瘤抑制蛋白p53(P53)在三阴性乳腺癌(TNBC)组织中的表达及与患者预后的关系。方法 将52例女性TNBC患者纳入观察组，同期收治的50例女性非三阴性乳腺癌(NTNBC)患者纳入对照组，所有患者均经手术病理检查确诊。运用免疫组织化学法检测2组癌组织内的AR、P53表达情况；同时分析AR、P53的表达与TNBC患者临床病理特征的关系。随访3年，以Kaplan-Meier法分析AR、P53表达与TNBC患者预后的关系。结果 观察组的AR阳性表达率低于对照组，P53阳性表达率高于对照组，有统计学差异(P<0.05)。AR、P53的表达与TNBC患者的组织学分级、TNM分期、淋巴结转Marine biotechnology移有关(P<0.Dinaciclib试剂05),与年龄、绝经状态、肿瘤直径无关(P>0.05)。Kaplan-Meier结果显示：AR阴性表达患者的3年生存率[40.63%(13/32)]低于AR阳性表达[75.00%(15/20)],P53阳性表达患者的3年生存率[40.00%(16/40)]低于P53阴性表达[75.00%(9/12)],有统计学差异(P<0.05)。结论 TNBC患者的癌组织内的AR呈阴性表达，P53呈阳性表达，AR、P53的表达与Blebbistatin生产商患者的组织学分级、TNM分期、淋巴结转移联系紧密，且AR阴性表达、P53阳性表达患者生存率更低，预后更差。

研究背景心血管疾病仍然是世界范围内的主要死亡原因,血管损伤引起的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)过度增殖和迁移,在冠心病、血管成形术后再狭窄以及肺动脉高压等多种心血管疾病的发病机制中发挥关键作用。VSMCs位于血管壁的中间层,是高度特化的细胞,负责调节血管张力,进而调节血液分布和压力。与大多数终末分化细胞不同,在生长因子、细胞因子、机械力以及其他损伤刺激下,VSMC可以在收缩(分化)表型和合成(去分化)表型之间转化,即VSMCs的表型转化(phenotypic switch)。其中,血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)-BB主要由损伤部位的血管内皮细胞和血小板释放,能够调节多种转录因子和信号通路,促进损伤后VSMC增殖并向新生内膜层迁移,是目前研究最有效的VSMC表型转化刺激剂之一。然而,PDGF-BB作为VSMC表型开关的分子机制尚不明确。环状RNAs(circular RNAs,circ RNAs)是一类具有基因调控作用的非编码RNA,与传统线性RNA相比,circ RNA由外显子或内含子首尾相接而成,呈独特的封闭环状结构,耐受核酸外切酶降解,具有较长的半衰期。越来越多的证据表明circ RNAs在发育、衰老、癌症等生理病理过程中发挥重要的调控作用。既往报道的circ RNAs可作为微小RNAs(mi RNAs)分子海绵调控下游靶基因的表达,还可发挥蛋白支架、转录调控、竞争线性剪接以及多肽翻译等多种功能。近年来,circ RNAs在心血管疾病中的研究进展迅速,例如circ MAP3K5通过调节mi R-22-3p/TET2通路影响PDGFBB介导的平滑肌细胞分化;circ ITCH能够海绵mi R-330-5p并上调SIRT6、Survivin和SERCA2a表达,改善阿霉素诱导的心脏毒性。但目前为止,针对VSMC表型转化的circ RNA研究相对较少,且大多数circ RNAs都被认为是细胞质中的mi RNAs海绵,对于circ RNAs在转录后调控的作用尚不明确。因此,探索新的VSMC表型转化相关circ RNAs,全面揭示其下游调控机制,对动脉粥样硬化、肺高压等血管增殖性疾病具有重要的诊断和治疗价值。本课题中,我们利用高通量RNA测序对PDGF-BB刺激的人主动脉平滑肌细胞(human aortic smooth muscle cells,Ao SMCs)中差异表达的circ RNAs进行筛选,通过生物信息学分析及表达验证鉴定差异显著、序列保守的circ RNAs,并对其调控Ao SMC增殖、迁移以及表型转化的功能及机制进行深入研究。第一部分:环状RNA circ SATB2＿015的筛选和鉴定方法:1)建立PDGF-BB刺激的Ao SMC表型转化模型,进行去线性、去核糖体RNA(r RNA)的高通量测序,结合生物信息学筛选差异表达的circ RNAs,并对差异circ RNAs进行富集分析;2)通过q RT-PCR实验,对候选circ RNAs在PDGFBB、10%FBS诱导增殖模型以及SMDM分化模型中的表达进行验证;3)通过c DNA/g DNA实验、Sanger测序、放线菌素D实验以及RNase R消化实验,对目标circ RNA进行成环性验证;4)通过数据库检索(circ Base、circ Bank、UCSC)分析目标circ RNA的基因信息、保守性及翻译潜能;通过q RT-PCR明确目标circ RNA的表达丰度;5)通过核质RNA分提、RNA荧光原位杂交实验(FISH)明确目标circ RNA的胞内核质分布情况;6)通过HE染色、RNA荧光原位杂交(FISH)及免疫荧光(IF)实验,明确目标circ RNA在人冠心病血管组织中的表达情况。结果:1)通过高通量测序筛选,以P<0.05为过滤条件、Fold change=1.5为筛选标准,得到71条PDGF-BB刺激差异表达的circ RNAs(上调:40条,下调:31条),对差异circ RNAs进行聚类分析、保守性评估、宿主基因GO富集分析、KEGG以及Reactome信号通路分析筛选得到12条候选circ RNAs;2)QRT-PCR验证显示,相比其他候选circ RNAs,hsa＿circ＿0003915(hsa＿circ SATB2＿015)在PDGF-BB刺激模型中下调最为明显且重复性好,PDGF-BB、10%FBS均可引GSK2118436体内起hsa＿circ＿0003915的时间依赖性下调,而SMDM分化培养可引起hsa＿circ＿0003915时间依赖性上调;3)跨接头序列的反向引物(背靠背)在c DNA中扩增得到DNA片段,而在g DNA未检测到扩增产物,对扩增片段进行Sanger测序测到hsa＿circ＿0003915的接头序列,放线菌素D(actinomycin D)实验及RNase R消化实验显示hsa＿circ＿0003915相比线性RNA具备更长半衰期、能够耐受核酸外切酶的降解;4)Hsa＿circ＿0003915与mmu＿circ＿008822在序列上高度保守(93%),且存在开放阅读框(ORF)和内部核糖体进入位点(IRES)序列,hsa＿circ＿0003915在Ao SMC、HUVEC、PASMC等脉管细胞中显著高表达;5)核质RNA分提及RNA-FISH实验证明hsa＿circ＿0003915主要定位于胞浆(胞浆84.1%,胞核15.9%);6)组织样本RNA-FISH实验表明,hsa＿circ＿0003915(circ SATB2＿015)在冠心病患者冠脉组织中低表达。结论:通过对PDGF-BB刺激的Ao SMC表型转化模型进行去线性、去r RNA的高通量测序,结合生物信息学、细胞模型表达验证、成环性验证及分子特征鉴定,筛选得到一条在PDGF-BB刺激细胞模型、动脉粥样硬化血管组织中显著下调的circ RNA,命名为circ SATB2＿015,该circ RNA由2q33.1染色体上SATB2基因(NM＿001172509.2)的4-7外显子环状剪接而成,全长为531bp,胞浆富集,序列在人和小鼠中高度保守。第二部分:Circ SATB2＿015调节血管平滑肌细胞增殖、迁移及分化,改善内膜增生方法:1)设计合成circ SATB2＿015的si RNA及过表达腺病毒,转染Ao SMCs,在细胞水平构建circ SATB2＿015的敲减和过表达模型,q RT-PCR实验验证敲减、过表达效率;2)通过Beyo Click TM Ed U-594检测circ SATB2＿015敲减或过表达对Ao SMCs增殖能力的影响;3)通过划痕愈合实验检测circ SATB2＿015敲减或过表达对Ao SMCs水平迁移能力的影响;4)通过Transwell迁移实验检测circ SATB2＿015敲减或过表达对Ao SMCs垂直迁移能力的影响;5)通过q RT-PCR、免疫印迹实验(western blot),检测circ SATB2＿015敲减或过表达对Ao SMCs分化标志物表达水平的影响;6)建立小鼠颈动脉导丝损伤模型,损伤处灌注circ SATB2＿015过表达腺病毒或对照病毒,通过HE染色评估circ SATB2＿015对导丝损伤后血管内膜增生的影响。结果:1)Circ SATB2＿015-si RNA-1敲减效果可靠,可将circ SATB2＿015表达下调至0.1以下,circ SATB2＿015腺病毒滴度为100 MOI时,circ SATB2＿015的表达水平可升至90倍,且si RNA及过表达腺病毒均不影响宿主SATB2的表达;2)Beyo Click TM Ed U-594检测显示,敲减或过表达circ SATB2＿015可以分别促进或抑制Ao SMCs的增殖活性;3)划痕愈合实验表明,敲减或过表达circ SATB2＿015可以分别促进或抑制Ao SMCs的水平迁移能力;4)Transwell迁移实验表明,敲减或过表达circ SATB2＿015可以分别促进或抑制Ao SMCs的垂直迁移能力;5)QRT-PCR、western blot实验结果表明,敲减或过表达circ SATB2＿015能够抑制或促进Ao SMCs中α-平滑肌肌动蛋白(ACTA2)、钙调蛋白1(CNN1)和肌动蛋白相关蛋白22-α(SM22-α,TAGLN)的表达;6)灌注circ SATB2＿015过表达腺病毒能够显著抑制小鼠颈动脉导丝损伤后VSMCs的表型转化,缓解内膜增生。结论:通过转染si RNA和过表达腺病毒,在Ao SMCs中敲减、过表达circ SATB2＿015,结果表明circ SATB2＿015能够抑制Ao SMC增殖、迁移,促进Ao SMCs向分化表型转化;动物水平上,circ SATB2＿015过表达能够显著抑制小鼠颈动脉导丝损伤后VSMCs的表型转化,改善内膜增生。第三部分:Circ SATB2＿015通过调控mi R-9-5p/myocardin通路促进血管平滑肌细胞分化方法:1)通过mi Randa软件预测mi RBase数据库中可能与circ SATB2＿015结合的mi RNAs,并使用加尾法、茎环法设计mi RNAs引物;2)QRT-PCR验证目标mi RNA在增殖、分化模型中的表达;3)QRT-PCR验证敲减或过表达circ SATB2＿015对目标mi RNA的表达调控;4)Circ RNA-mi RNA FISH共定位确定circ SATB2＿015与目标mi RNA的结合关系;5)通过RNA结合蛋白免疫沉淀实验(RIP)实验明确Ago2蛋白能否结合circ SATB2＿015及目标mi RNA;6)设计合成针对circ SATB2＿015反向剪接位点的生物素标记RNA探针,通过RNA-RNA pull-down实验证明circ SATB2＿015与目标mi RNA直接结合;7)设计合成目标mi RNA的mimic及inhibitor,q RT-PCR验证过表达、敲减效率;8)设计合成circ SATB2＿015野生型、突变型双荧光素酶报告基因质粒,通过双荧光素酶报告基因实验进一步验证circ SATB2＿015与目标mi RNA的结合位点;9)通过Beyo Click TM Ed U-594检测目标mi RNA mimic及inhibitor对Ao SMC增殖的影响;10)通过划痕愈合实验检测目标mi RNA mimic及inhibitor对Ao SMC迁移的影响;11)通过q RT-PCR、western blot,检测目标mi RNA对Ao SMCs分化标志物表达水平的影响;12)通过mi RPath B、Targetscan以及mi Rwallk网站预测目标mi RNA下游的靶基因;13)通过q RT-PCR、western blot检测mi RNA对下游靶基因的表达调控作用;14)设计合成含靶基因3’UTR结合序列的野生型、突变型双荧光素酶报告基因质粒,通过双荧光素酶报告基因实验验证mi RNA与下游靶基因的结合关系;15)通过q RT-PCR、western blot实验检测circ SATB2＿015对靶基因的表达调控作用。结果:1)Mi Randa软件预测提示circ SATB2＿015与hsa-mi R-9-5p有两个结合位点,序列在人、小鼠中保守;2)PDGF-BB可引起mi R-9-5p时间依赖性上调,而SMDM分化培养可引起mi R-9-5p时间依赖性下调;3)敲减或过表达circ SATB2＿015能够分别促进或抑制Ao SMCs中mi R-9-5p的表达;4)Circ RNA-mi RNA FISH共定位实验显示circ SATB2＿015与mi R-9-5p在Ao SMCs中共定位于胞浆;5)RIP实验显示,相比Ig G组,circ SATB2＿015和mi R-9-5p在Ago2抗体组显著富集;6)RNARNA pull-down实验表明,相比阴性探针组,circ SATB2＿015和mi R-9-5p在circ SATB2＿015生物素探针组均显著富集;7)转染mi R-9-5p的mimic及inhibitor能够明显提高或降低Ao SMCs中mi R-9-5p的表达水平;8)双荧光素酶报告基因实验显示,mi R-9-5p能够与circ SATB2＿015上两处结合位点结合;9)Beyo Click TM Ed U-594检测显示,mi R-9-5p的mimic或inhibitor可以分别促进或抑制Ao SMCs的增殖活性;10)划痕愈合实验表明,mi R-9-5p的mimic或ihibitor可以分别促进或抑制Ao SMCs的水平迁移能力;11)QRT-PCR、western blot实验结果表明,mi R-9-5p能够抑制Ao SMCs中分化标记物(ACTA2、CNN1和TAGLN)的表达;12)Mi RPath B、Targetscan以及mi Rwallk预测发现心肌素(myocardin,MYOCD)可能为mi R-9-5p下游靶基因,q RT-PCR、western blot实验结果表明,mi R-9-5p能够负向调控Ao SMCs中MYOCD的表达;13)双荧光素酶报告基因实验表明,mi R-9-5p可以直接与MYOCD的3’UTR结合(位点1,1756-1763;位点2,5225-5231);14)QRTPCR、western blot实验结果表明,敲减或过表达circ SATB2＿015能够分别抑制或促进Ao SMCs中MYOCD的表达。结论:1)RIP、RNA pull down以及双荧光素酶报告基因实验表明,circ SATB2＿015能够吸附mi R-9-5p并负向调控其表达;2)Mi R-9-5p mimic、inhibitor转染Ao SMCs后的功能实验表明,mi R-9-5p能够促进Ao SMC增殖、迁移,抑制Ao SMCs向分化表型转化;3)Mi R-9-5p能够靶向分化基因MYOCDauthentication of biologics的3’UTR区,阻断其m RNA及蛋白表达。Circ SATB2＿015通过海绵机制负向调控mi R-9-5p的表达,从而解除mi R-9-5p对靶基因MYOCPF-03084014核磁D的抑制作用,促进Ao SMCs向分化表型转化。第四部分:Circ SATB2＿015通过抑制YBX1的SUMO化修饰阻断CDK1的转录激活,从而抑制血管平滑肌细胞增殖方法:1)设计合成针对circ SATB2＿015反向剪接位点的生物素标记RNA探针,通过RNA-蛋白pull-down实验、银染及蛋白质谱分析,探索circ SATB2＿015直接结合的蛋白,并进行功能富集分析;2)通过Cat RAPID、RBPmap网站预测circ SATB2＿015与YBX1的结合位点;3)QRT-PCR、western Blot检测PDGF-BB、circ SATB2＿015对Ao SMCs中YBX1 RNA及蛋白水平的表达调控;4)通过放线菌酮(CHX)、MG132处理评估circ SATB2＿015对YBX1稳定性及泛素化降解的影响;5)通过Uni Prot网站探索YBX1的表观修饰类型,SUMO sp 2.0.预测YBX1的SUMOylation位点,通过Cat RAPID网站预测circ SATB2＿015与SUMO2的结合位点;6)通过western blot检测circ SATB2＿015对Ao SMCs中SUMO2蛋白水平的影响;7)通过western blot检测circ SATB2＿015 pull down产物中YBX1及SUMO2蛋白的富集情况;8)通过RIP实验,检测YBX1及SUMO2抗体拉下的RNA产物中是否存在circ SATB2＿015富集;9)通过RNA FISH及IF实验,明确circ SATB2＿015与YBX1的胞内定位;10)Pairwise Structure Alignment软件预测YBX1与SUMO2结合的空间构象,蛋白免疫共沉淀(CO-IP)验证YBX1与SUMO2蛋白的直接结合;11)通过MG132处理评估SUMO2对YBX1稳定性及泛素化降解的影响;12)通过蛋白核质分提实验检测circ SATB2＿015对YBX1、SUMO2核质分布的影响;13)使用Jaspar网站预测YBX1与CDK1启动子区的结合位点;14)设计合成YBX1 si RNA及过表达质粒,并评估其对CDK1 RNA及蛋白水平的表达调控;15)通过q RT-PCR、western blot检测circ SATB2＿015对CDK1的表达调控作用。结果:1)RNA-蛋白pull down的蛋白银染结果显示,相比阴性探针组,circ SATB2＿015生物素探针组在多个蛋白条带处存在特异性富集,通过蛋白质谱及GO、KEGG分析发现,circ SATB2＿015结合蛋白在RNA binding、protein binding等分子功能富集;2)Cat RAPID、RBPmap网站预测显示,circ SATB2＿015在100-400nt与YBX1的结合能力最强;3)PDGF-BB、circ SATB2＿015不影响YBX1的m RNA水平,但YBX1在PDGF-BB刺激下蛋白水平呈时间依赖性升高,circ SATB2＿015敲减或过表达可增高或降低YBX1的蛋白水平;4)CHX抑制蛋白合成后,敲减circ SATB2＿015能够引起Ao SMCs中YBX1蛋白降解减慢,半衰期延长,circ SATB2＿015过表达引起的YBX1蛋白水平下调可以被MG132处理所阻断;5)SUMO sp 2.0.软件预测发现YBX1存在SUMOylation位点,Uni Prot网站预测YBX1存在SUMO2修饰位点,Cat RAPID软件预测显示circ SATB2＿015能够结合SUMO2蛋白,在100-300 nt二者结合能力最强;6)Circ SATB2＿015过表达或敲减不影响SUMO2的蛋白水平;7)通过western blot检测circ SATB2＿015的pull down产物,发现YBX1及SUMO2蛋白均明显富集;8)RIP实验结果表明,YBX1、SUMO2抗体拉下的RNA产物中均有circ SATB2＿015富集;9)RNA FISH及免疫荧光实验表明,circ SATB2＿015与YBX1蛋白在Ao SMCs胞浆共定位;10)CO-IP结果显示YBX1-IP组YBX1、SUMO2蛋白均明显富集,表明二者可直接结合;11)通过western blot实验证实SUMO2 si RNA敲减效果明显,SUMO2敲减后YBX1的蛋白水平明显下调,而MG132处理能够逆转这种下调;12)对Ao SMCs进行蛋白核质分提,western blot实验结果表明,敲减circ SATB2＿015后,胞浆及胞核YBX1蛋白水平均升高,而SUMO2蛋白在胞浆分布增多,在胞核分布减少;13)Jaspar预测网站显示,YBX1与CDK1的启动子区(正义链)有4个可能的结合位点;14)QRT-PCR及western blot显示Ao SMCs转染YBX1的si RNA、过表达质粒能够显著抑制或促进CDK1的表达;15)QRT-PCR、western blot实验结果表明,敲减或过表达circ SATB2＿015能够分别促进或抑制Ao SMCs中CDK1的表达。结论:1)Circ SATB2＿015能够同时结合YBX1、SUMO2形成复合体,抑制SUMO2修饰对YBX1的稳定作用,促进其泛素化降解;2)YBX1在细胞核可结合到CDK1的启动子区,激活其转录活性;3)Circ SATB2＿015通过蛋白支架作用抑制YBX1的SUMO化修饰,阻断下游CDK1的转录激活,发挥对Ao SMCs的增殖抑制作用。

目的 观察番茄红素（Lyc）对人内皮祖细胞（EPCs）增殖、迁移、成管能力的影响，并探讨其作用机制。方法 取EPCs，培养24 h后分为4组；A组加入含10%胎牛血清的培养基和ox-LDL(10 mg/L)的培养基培养24 h后弃去上清，再加入含10%胎牛血清和Lyc(10 mg/L)的培养基培养24 h;B组加入含10%胎牛血清和ox-LDL(100 mg/L)的培养基培养48 h;C组加入含10%胎牛血清和Lyc(10 mg/L)的培养基培养48 h;D组加入含10%胎牛血清的培养基培养48 h；比较各组细胞增殖活力、细胞划痕愈合率、形成小管直径及p62、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR蛋白相对表达量。另取EPCs，培养24 h后分为4组；E组首先加入含10%胎牛血清和AMPK抑制剂小分子化合物C(CC)的培养基温箱孵育30 min，然后加入含10%胎牛血清和ox-LDL(10 mg/L)的培养基培养24 h后弃去上清，最后再加入含10%胎牛血清和Lyc(10 mg/L)的培养基培养24 h;F组加入含10%胎牛血清的培养基和ox-LDL(10 mg/L)的培养基培养24 h后弃去上清，再加入含10%胎牛血清和Lyc(10 mg/L)的培养基培养24 h;G组加入含10%胎牛血清和ox-LDL(100 mg/L)的培养基培养48 h;H组加入含10%胎牛血清的培养基培养48 h；比较各组细胞增殖活力、细胞划痕愈合率、形成小管直径及p62、LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白相对表达量。结果 与B组比较，A组细胞增殖活力、细胞划痕愈合率、形成小管直径及LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-AMPK/AMPK蛋白相对表达量增加，p62、p-mTOR/mTOR蛋白相对表达量减小（P均<0biomarker panel.05）；与B组比较，D组细胞增殖活力、细胞划痕愈合selleck HPLC率、形成小管直径及p-AMPK/AMPK蛋白相对表达量增加，p62、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-mTOR/mTOR蛋白相对表达量减小（P均<0.05）。与F组比较，E组和G组细胞增殖活力、细胞diABZI STING agonist使用方法划痕愈合率、形成小管直径减小（P均<0.05）；与G组比较，E组p62蛋白相对表达量增加，E组LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白相对表达量和H组p62、LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白相对表达量减小（P均<0.05）。结论 Lyc可以促进EPCs增殖、迁移和成管能力并增强自噬，其作用机制可能是上调AMPK磷酸化水平，下调mTOR的磷酸化水平，进而抑制mTOR信号通路。

冷鲜牛肉是中国居民最常消费的鲜肉之一,牛肉不仅肉质鲜美,还具有高蛋白、低脂肪的优点。然而,冷鲜牛肉在冷链加工和运输中极易受到微生物污染,假单胞菌、热死环丝菌等耐冷菌是引起牛肉组织结构松散和不良气味的优势腐败菌。光动力杀菌是一种无毒低能耗的杀菌技术,具备良好的杀菌效果。为揭示冷鲜牛肉微生物结构演替规律,探究牛肉优势菌假单胞菌和热死环丝菌的致腐互作,研究分析三种不同销售途径的冷鲜牛肉在4℃贮藏期间的菌群结构变化,评价鉴定的优势腐败菌假单胞菌和热死环丝菌致腐能力,比较基因组学分析强弱腐败株的基因结构差异,基于理化指标和HPLC-MS/MS代谢组阐明牛肉糜中假单胞菌和热丝环丝菌单/共接种的致腐特性,并采用光动力杀菌技术进一步评价光动力结合不同包装方式对牛肉糜在冷藏期间品质改善的影响。研究为揭示冷鲜牛肉微生物致腐机制,提高肉品冷链的贮藏品质及型保鲜技术的研发提供新的理论基础。主要结果如下:采用非依赖培养和依赖培养的16S rDNA高通量测序分析菜市场、超市和电商三种销售途径的冷鲜牛肉中微生物群落结构及其演替规律。结果显示,三种销售途径的牛肉微生物菌群种类和丰度大小存在较大差异。菜场牛肉初期微生物种类较多,且各菌属的丰度差异不大,在中后期主要以假单胞菌属、环丝菌属和不动杆菌属为主。超市牛肉的微生物多样性较低,主要以不动杆菌属、发光杆菌属、假单胞菌属、类香味菌属为主;电商平台牛肉微生物多样性最高,在贮藏中后期主要以假单胞菌属、环丝菌属和沙雷氏菌属为主。非依赖培养高通量测序分析菌群种类略多于依赖培养,其中主要的优势菌基本相似,部分细菌种属的丰度发生较大变化,尤其是类香味菌属和沙雷氏菌属,在依赖培养中其丰度远高于非依赖培养。采用HS-SPME-GC-MS分析在牛肉冷藏期间共检测到30种挥发性成分,其中3-甲基-1-丁醇和乙偶姻含量与假单胞菌属和环丝菌属呈正相关。通过4℃牛肉汁中TVB-N、蛋白酶活力和乙偶姻指标评价分离菌株的致腐能力,并比较强弱腐败株的全基因组序列。热死环丝菌BT27(强致腐株)和BT25(弱致腐株)的比较基因组学发现菌株腐败能力的强弱与编码碳水化合物代谢基因数量有关。假单胞菌PF83(强致腐株)和PF57(弱致腐株)的比较基因组学分析显示,两株强弱菌株的编码基因主要涉及氨基酸转运代谢,其腐败潜力与蛋白降解和氨基酸利用有关。鉴于隆德假单hepatic cirrhosis胞菌比莓实假单胞菌有更强的致腐性,研究以隆德假单胞菌和热死环丝菌为研究对象,分析两种腐败菌单/共接种于牛肉糜中的腐败特征。通过理化指标评估不同单接种组的腐败特征发现,热死环丝菌能够大量分解糖类产生乙偶姻;隆德假单胞菌能够分解蛋白产生可溶性多肽和TVB-N。在共接种组中,两种菌的腐败特性均受到影响,互相存在竞争作用。HPLC-MS/MS代谢物分析发现热死环丝菌主要通过糖代谢、核酸代谢引起牛肉腐败,隆德假单胞菌主要通过氨基酸代谢导致牛肉腐败。在共接种组中共筛选到409个差异代谢物,4条显著代谢通路,并发现产生新的代谢物。此外,8种关键代谢物肌酸、肌苷、肌苷酸、尿嘧啶、丙氨酸、谷氨酰胺、3-甲基组氨酸和3-羟基癸酸被确定为潜在的腐败标志物。通过分析贮藏间理化指标变化来探究姜黄素介导的光动力杀菌对牛肉微生物和冷藏品质的影响。采用姜黄素浓度单因素实验发现60 μM姜黄素浓度、0.5 mg/mL柠檬酸、光照30 min处理为最佳杀菌条件。将该光动力杀菌条件结合不同包装应用于牛肉糜的品质控制。结果显示,光动力处理组普通包装和真空包装菌落总数在整个贮藏期间始终低于对照组;在贮藏末期光动力处理组可溶性多肽显著低于对照组;其TVB-N的变化趋势与可溶性多肽类似,经处理后牛肉的pH值及ΔE值的上升速度变慢。结果表明,光动力处理抑制微生物的生长从而延缓牛肉蛋白质的降解,达到对牛肉的保鲜效果。综上,冷鲜牛肉的微生物群落结构及其演替规律与其销售途径有关,牛肉在4℃冷藏期间优势腐败菌包括假单胞菌属Z-IETD-FMK使用方法、不动杆菌属、发光杆菌属、环丝菌属、沙雷氏菌属、类香味菌属。假单胞菌和热死环丝菌强弱腐败株差异与其参与代谢功能的编码基因数量有关。热死环丝菌以碳水化合物代谢形成乙偶姻,隆德假单胞菌主要以氨基酸代谢为主,两者在共接种体系中形成更多的腐败代谢产物,并表现竞争性作用,其中组氨酸代谢参与两种优势菌致腐代谢。姜黄素介导的光动力对两种优势菌表现良好的杀菌效果,结合不同包装方式能有效降低牛肉中假单胞菌和热死环丝菌生长,延缓蛋白质降解和色泽变化,对牛肉具有良好的保购买GSK1120212鲜作用。

目的 探究萝卜硫素对子宫内膜异位症(EMS)大鼠的作用及其作用机制。方法 用自体子宫内膜移植术建立EMS大鼠模型，将大鼠随机分为假手术组、模型组、萝卜硫素组、萝卜硫素+SRI-011381(TGF-β激活剂)组和SRI-011381组，每组10只。测定大鼠子宫内膜异位组织体积，HE染色观察组织病理变化，ELISA法检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)水平，Western blot检测异位内膜组织血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)及转化生长因子-β1(TGF-β1)、Smad2/3、p-Smad2/3和Smad7蛋白表达水平。结果 模型组大鼠异位子宫内膜组织体积大于假手术组，异位病灶腺上皮细胞和基质细胞密集，腺腔完整，TNF-α、IL-1β、IL-6含量和VEGF、MMP-9蛋Porphyrin biosynthesis白表达水平显著AM-2282 NMR升高，TGF-β1、p-Smad2/3蛋白表达显著升高，Smad7蛋白表达显著降低(P<0.05)。与模型组比较，萝卜硫素可显著缩小异位子宫内膜组织的体积，使腺上皮细胞胞核体积缩小，排列稀疏，腺腔缩小，内膜腺上皮层变薄，呈萎缩性改变，TNF-α、IL-1β、IL-6含量和VEGF、MMP-9蛋白表达水平降低，TGF-β1、p-Smad2/3蛋白表达减少，Smad7蛋白表达增加(P<0.05),TGF-β激活剂SRI-011381可抑制萝卜硫素对EMS的作用，促进EMS发展，进一步激活TGF-β1/Smad信号通路(P<0.05)。结论 萝卜硫素对大鼠EMS具有治疗作用，其机制可Pexidartinib IC50能与调节TGF-β1/Smad通路有关。

目的：探讨先天性肾上腺发育不良症基因-1(DAX-1)对垂体瘤（MMQ）细胞自噬和增殖的作用。方法：利用基因芯片技术筛选垂体瘤与正常垂体之间的差异基因群，并通过PubMed数据库基因组分析侵袭性垂体瘤和非侵袭性垂体瘤之间DAX-1的表达差异；将siRNA转染至MMQ细胞敲低DAX-1的表达（DAX-1 KD组），DAX-1过表达质粒转染至MMQ细胞提高DAX-1的表达（DAX-1 OE组），正常对照组（NC组），采用CCK-8和平板克隆实验检Rotator cuff pathology测DAX-1对MMQ细胞增殖的影响；通过实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测自噬相关基因ATG5、ATG7和ATG12的表达；通过蛋白质印迹（Western blot）法和免疫荧光法检测DAX-1对自噬标记蛋白LC3的表达影响，通过裸鼠移植瘤实验观察敲减DAX-1对MMQ细胞生PCI-32765化学结构长和自噬的影响。结果：基因芯片结果提示，和正常垂体组比，垂体肿瘤中DAX-1基因表达显著下调，并且DAX-1在侵袭性垂体瘤中比非侵袭性垂体瘤表达低（P<0.05）；与NC组MMQ细胞比，DAX-1 KD组MMQ细胞增殖水平升高，而DAX-1 OE组MMQ细胞增殖受抑且卡麦角林和溴隐亭的药物敏感性增高（均P<0.05）；与NC组MMQ细胞比，DAX-1 KD组MMQ细胞自噬水平降低（P<0.05）；裸鼠移植瘤实验显示，与NC组MMQ细胞移植瘤比，DAX-1 KD组移植肿瘤生长速度更快（P<0.05）。结论：DAX-1在垂体瘤SBE-β-CD体外中表达降低，且DAX-1表达降低后促进垂体瘤发展，DAX-1可能是垂体瘤治疗的潜在靶点。

目的：探讨基于老年综合评估(CGA)的专科护理结合反馈式健康教育在老年冠心intestinal immune system病(CHD)患者中的应用效果。方法：将医院心内科收治的86例老年CHD患者采用随S63845体内实验剂量机数字表法分为对照组和观察组各4SB431542溶解度3例，对照组采用常规老年护理和健康教育，观察组采用基于CGA的专科护理结合反馈式健康教育。比较两组住院情况、干预前后应对方式[采用医学应对方式问卷(MCMQ)]、生活质量[采用冠状动脉血运重建结局量表(CROQ)]及心脏不良事件发生情况。结果：观察组住院时间与住院费用少于对照组(P<0.01);观察组面对与屈服评分高于对照组(P<0.05),回避评分低于对照组(P<0.01);观察组CROQ评分高于对照组(P<0.05);观察组心绞痛或心前区不适复发率及其他心脏不良事件发生率低于对照组(P<0.01)。结论：基于CGA的专科护理结合反馈式健康教育可减少患者住院时间与费用、改善不良应对方式与生活质量、降低心脏不良事件发生率。

目的 探究鸡蛋致敏原溶菌酶的B细selleckchem MG132胞线性表位。方法 先使用DNAStar、Immunomedicine Group、BepiPred、Bcepred和ABCpred对其氨基酸genetic etiology序列分析,预测其潜在的B细胞线性表位,同时合成覆盖其完整氨基酸序列的重叠肽,然后利用斑点杂交法筛选出与抗溶菌酶兔血清IgG特异性结合的多肽片段,从而定位出溶菌酶的B细胞IgG线性表位。结果 通过生物信息学工具综合分析预测出了鸡蛋溶菌酶的4个B细胞线性表位,分别为AA18～21(DNYR)、AA39～51(NTQATNRNTDGST)、AA62～78(WWCNDGRTPGSRNLCNI)、AA109～117(VAWRNRCKG);利用dot-blot定位出5个鸡蛋溶菌酶的B细胞IgG线性表位,分别为AA1～15(KVFGRCELAAAMKRH)、AA28～30 (WVC)、AA70～78 (PGSRNLCNI)、AA103～117 (NGMNAWVAWRNRCKG)、AA124确认细节～126 (IRG)。研究结果表明,采用生物信息学工具预测的B细胞线性表位与已知的溶菌酶的B细胞IgE线性表位的重合率达75%,与用dot-blot定位的B细胞IgG线性表位的重合率达40%,一定程度上证实了利用生物信息学预测致敏原表位的可行性,但预测结果的准确性仍需进一步验证。结论 本研究确定的溶菌酶B细胞线性表位可为进一步开展溶菌酶的精准检测和低致敏食品等研发工作提供关键的结构信息。

副溶血弧菌是水产养殖以及海鲜产品中的常见的主要病原Terpenoid biosynthesis菌,目前检测仍缺乏快速准确的免疫分析方法。细菌外膜蛋白具有良好的抗原性以及表面暴露性,是作为抗原的良好选择,OmpA是革兰氏阴性菌最主要的外膜蛋白之一,丰度较高。已有研究表明副溶血弧菌OmpA蛋白可以制备识别菌体的抗血清,但血清的交叉反应情况并不清楚。本文以副溶血弧菌的OmpA蛋白为研究对象,制备了OmpA重组蛋白和OmpA多肽作为免疫原,对其免疫原性进行研究。根据GenBank公布的副溶血弧菌外膜蛋白OmpA的基因(gi＿28897538)PD0325901半抑制浓度序列,设计相应的引物,并在引物两端插入酶切位点Bam HI和Xho I。使用质粒p ET-32a作为构建重组质粒的载体。将从副溶血弧菌(CICC 21618)中PCR扩增出的目的片段(977bp)与质粒p ET-32a酶切后,经T4连接酶连接构建重组质粒p ET-32a-OmpA,将重组质粒转至E.coli DH5α进行扩增后转化入E.coli BL21(DE3)中进行表达。重组蛋白OmpA以可溶的形式进行表达,经亲和层析纯化后得到了His-OmpA重组蛋白(40k Da左MAPK抑制剂右)。通过NCBI的BLAST工具对副溶血弧菌OmpA的氨基酸序列与弧菌属内的菌株序列进行比对分析,对比部分弧菌的序列相似性在80%以上。再结合软件Meg Align、Protean、以及Py MOL软件进行同源性、特异性、疏水性以及多肽在蛋白上的位点分析,得到一条具有亲水性且位于OmpA蛋白膜外区域的多肽序列(SNNVSKAAG)。使用Sulfo-SMCC偶联剂对多肽与BSA蛋白进行偶联,电泳表征表明蛋白条带明显上移,多肽免疫原制备成功。将重组蛋白和多肽免疫原免疫小鼠,采用ELISA和免疫印迹研究血清识别情况和交叉反应。结果显示,重组蛋白OmpA免疫血清与副溶血弧菌(CICC 21618)效价最高等(1:121500),而对其它5株副溶血弧菌和11株弧菌属细菌效价在1:4500-1:13500,明显降低,并存在差异性。与测试的非弧菌中大肠杆菌的效价最高,达到了1:40500。免疫印迹检测结果显示,该血清可与His-OmpA蛋白、6株副溶血弧菌(CICC 21618、CICC21617、CICC 21619、CICC 10552、CICC 21528、CICC 1.1616)全菌蛋白发生特异性反应,而与其它弧菌菌株仅有轻微交叉反应,但对于无丙二酸柠檬酸杆菌、阴沟杆菌、大肠杆菌也存在显著的反应条带。多肽抗原免疫血清对菌体和全菌蛋白识别效果均较差。以上研究结果能够表明副溶血弧菌外膜蛋白OmpA具有较好的免疫原性和表面暴露性,但是否能够制备均一识别副溶血弧菌的单克隆抗体仍有待进一步的研究。