S6 kinase 信号通路

目的 探究吴茱萸碱对哮喘小鼠的气道重塑和炎症反应的影响及其相关机制。方法 48只BALB/c小鼠按随机数字法分为正常对照组、模型组、吴茱萸碱组和吴茱萸碱处理的过表达Notch信号通路抑制剂Kyo T2的腺病毒载体干预组，每组12只。采用卵清蛋白（OVA）诱导GNE-140研究购买建立小鼠哮喘模型，吴茱萸碱组和吴茱萸碱加Kyo T2腺病毒载体干预组以30 mg/kg的吴茱萸碱溶于生理盐水灌胃，其中，吴茱萸碱加Kyo T2腺病毒载体干预组经鼻滴入5×10~8pfu的Kyo T2腺病毒干预，其余组灌胃等量的生理盐水。末次激发24 h后，收集支气管肺泡灌洗液（BALF），进行细胞计数；ELISA法检测炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-4和OVA特异性IgE和IgG_1；过碘酸雪夫（PAS）染色法检测气道杯状细胞增生；Masson染色法观察肺组织胶原沉积现象；免疫microbial infection组化法检测α-SMA的表达；Western blot法检测α-SMA、Hes1、Skp2蛋白的表达。结果 与对照组相比，模型组小鼠BALF中总细胞和嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细Gefitinib-based PROTAC 3浓度胞数均显著升高（P <0.05）,TNF-α、IL-1β、IL-4因子水平上升（P <0.05）,α-SMA、Hes1和Skp2的表达上调（P <0.05）。与模型组相比，吴茱萸碱组和吴茱萸碱加Kyo T2腺病毒载体干预组BALF中总细胞和嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞数显著降低（P <0.05）,TNF-α、IL-1β、IL-4因子水平下调（P<0.05）,α-SMA、Hes1和Skp2的表达降低（P <0.05），气道炎症得到明显改善；与吴茱萸碱组相比，吴茱萸碱加Kyo T2腺病毒载体干预组炎性因子显著降低，通路蛋白下调，气道炎症改善更为显著（P <0.05）。结论吴茱萸碱对哮喘小鼠气道重塑和炎症反应的改善，可能与Notch通路抑制Skp2的表达相关。

目的：观察表没食子酸儿茶素https://www.selleck.cn/products/Docetaxel(Taxotere).html没食子酸酯（EGCG）的抗程序Benign mediastinal lymphadenopathy性坏死作用并探讨其机制。方法：培养L929小鼠成纤维肉瘤细胞和3T3小鼠成纤维细胞，以不同浓度的EGCG作用24 h,MTT法观察EGCG毒性。复制TNFα诱导的L929细胞程序性坏死、Z-VAD诱导的L929细胞程序性坏死和TNFα复合Z-VAD诱导的3T3细胞程序性坏死三种经典模型，以EGCG干预，MTT法测定细胞活力，计算EGCG对程序性坏死的抑制率，相差显微镜观察细胞形态。在TNFα诱导的L929细胞模型中，Western blot法检测受体相互作用蛋白1(RIP1)和RIP3的表达，荧光显微镜观察线粒体形态，流式细胞术检测线粒体和细胞内超氧阴离子含量。结果：EGCG在10selleck产品0 mg/L以下对L929和3T3细胞没有毒性；在12.5～50 mg/L对程序性坏死导致的细胞活力下降具有显著抑制作用，并且改善细胞形态，同时可以抑制RIP1和RIP3的表达增加、线粒体的过度分裂及线粒体和细胞内超氧阴离子浓度的升高，这些作用均呈浓度依赖性。结论：EGCG具有显著的抗程序性坏死作用，这一作用与其对程序性坏死通路的阻抑有关。

研究目的:1.单中心瘢痕疙瘩住院患者接受手术及放疗后复发的临床预测模型及nomogram建立。2.基于机器学习方法建立瘢痕疙瘩患者的三种复发预测模型并进行评估及比较。3.研究不同严重程度的瘢痕疙瘩炎性相关差异表达基因并进行注释和挖掘hub基因。4.基于复发相关因素分析的瘢痕疙瘩表皮下血管网皮瓣的设计改进,探索该皮瓣的最Resultados oncológicos佳长宽比。研究方法:1.搜集2015-2019年度北京协和医院的瘢痕疙瘩住院患者的电子病历信息,对患者进行随访,以2年内是否复发为结局终点。排除失访者及缺失数据后,以胸部瘢痕疙瘩患者数据集为训练集,建立逻辑回归模型和nomogram,并在非胸部瘢痕疙瘩患者数据集中进行验证。2.纳入301例接受手术及术后放疗的瘢痕疙瘩患者,其中70%作为训练集,30%作为验证集。在训练集中建立三种复发预测模型:逻辑回归模型、决策树模型、随机森林模型。在测试集中对三种模型进行评估和比较,包括准确度、灵敏度、特意度、召回率、精确度、和kappa系数,并计算三种模型ROC曲线下面积(AUC)。3.根据瘢痕疙瘩增生活动度评分,选择6例重度瘢痕疙瘩标本(KAAS≥7)和6例轻度瘢痕疙瘩标本(KAAS<4),使用免疫应答研究检测试剂盒进行高通量测序,对测序数据进行生物信息学分析,比较2组间的差异表达基因(DEGs),挖掘hub基因。对差异表达基因进行基因本体论(GO)注释和KEGG通路富集分析,进一步确定差异基因的主要功能和相关通路。4.设计前瞻性临床研究,精确记录瘢痕疙瘩表皮下血管网皮瓣的长度和宽度,血流灌注情况,并对患者进行随访,根据临床数据进行统计学分析,找出该种特殊皮瓣合适的长宽比。研究结果:1.瘢痕疙瘩增生活动度评分(KAAS)和术后是否出现并发症建立逻辑回归预测模型和nomogramLorlatinib说明书,该模型在胸部瘢痕疙瘩训练集的AUC=0.871,在非胸部瘢痕疙瘩的测试集AUC=0.802。具有良好的预测效用。2.基于机器学习方法建立了三种瘢痕疙瘩复发预测模型,瘢痕疙瘩增生活动度,血压水平,术后是否出现并发症以及炎性细胞比例等因素在其中参与重要作用,在不同维度比较三种模型,准确度:决策树>随机森林>逻辑回归;精确度:决策树>随机森林>逻辑回归;AUC:逻辑回归>随机森林>决策树。3.共发现123个差异表达基因,45个上调基因,78个下调基因,CCR7在重度组表达水平显著高于轻度组(P<0.05),ROC曲线提示CCR7的表达水平具有良好的辨别重度和轻度组的能力,AUC=0.833。GO富集的生物过程类别包括T细胞激活调控、白细胞激活的正调控等过程,分子功能主要包括细胞因子受体结合、酰胺结合、免疫受体激活,细胞组分分析提示主要位于细胞质膜的外侧、内吞膜泡部位。KEGG pathway富集分析在细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路富集最多,其次在细胞粘附分子通路。4.手术后第一天和拆线当天的平均血流灌注量分别为120.4013和168.6900(p=0.02249);2例皮瓣出现部分坏死(5.714%)。FG-4592体内ROC曲线分析显示,当长宽比<1.05时,皮瓣质量良好(AUC=0.724),提示该种皮瓣的有效安全长宽比为1.05。随访11-13个月,观察到1名患者出现部分切口瘢痕增生,但没有观察到瘢痕疙瘩复发。研究结论:1.瘢痕疙瘩增生活动度评分表可用于预测复发,本研究建立了预测瘢痕疙瘩手术及辅助放疗后2年复发的列线图。2.基于机器学习方法建立了三种瘢痕疙瘩复发预测模型,发现瘢痕疙瘩增生活动度,血压水平,术后是否出现并发症以及炎性细胞比例等因素在其中参与重要作用,在不同维度比较了三种模型,预测效能方面(AUC),逻辑回归模型效能最佳。3.CCR7的表达水平提示了瘢痕疙瘩的严重程度,调节该基因可能有助于预防、缓解瘢痕疙瘩或者改善瘢痕疙瘩治疗的效果。瘢痕疙瘩的严重程度和免疫调节通路密切相关。4.保留瘢痕疙瘩表皮下血管网皮瓣方式可以提供足够的血流灌注和充足的皮肤量覆盖缺损,对于这种特殊的皮瓣设计,推荐的皮瓣设计长宽比不应超过1,联合高压氧治疗可以改善皮瓣的血运,减少术后并发症的发生。

水稻是世界上最重要的作物之一。在水稻籽粒中存在淀粉和蛋白质两大组分,两者的均衡分配以及淀粉的理化特性是购买Belnacasan稻米品质的评价标准。氮是高等植物所需要的最重要的矿物质营养素之一。当氮肥过量施放后,不仅会出现养分利用不充分、效率低下、影响作物的产量和粮食的品质等问题,更是存在严重的环境污染问题。另外氮素调节籽粒淀粉品质形成的分子机制目前尚未清楚。因此,除了合理施放氮肥外,开发具有提高氮利用效率的遗传品种对于可持续农业来说至关重要。水稻转录因子DNA BINDING WITH ONE FINGER 18(OsDOF18)可以介导根部对铵根离子的转运,调节水稻对氮素的吸收。在本研究中,使用以传统品种粳稻“日本晴”为遗传背景的osdof18突变体和OsDOF18-OX转基因株系作为试验材料,对成熟籽粒的外观形态品质、营养成分和淀粉理化特性进行相关研究。主要的研究结果如下:(1)当OsDOF18发生突变后,水稻根部氮素吸收能力下降,并且影响氮素在籽粒中的分布;水稻籽粒氮含量不足,发育变差,最终影响籽粒淀粉的理化特性。osdof18突变系水稻籽粒长度显著增加,总淀粉含量和蛋白质含量显著减少,但通过施氮可以使蛋白质含量增加;osdof18突变体籽粒淀粉中存在较多的小颗粒淀粉,减小了籽粒淀粉的平均粒径;表观直链淀粉含量降低;籽粒淀粉的有序度降低;支链淀粉的链长没有变化;淀粉的相对结晶度降低,无定形峰面积提高。(2)当OsDOF18过表达后,水稻籽粒的宽度显著增加,粒长不变,蛋白质含量和总淀粉含量显著增加;OsDOF18过表达植株籽粒存在较多的中大颗粒淀粉,增大了淀粉的平均粒径;表观直链淀粉含量增加;籽粒淀粉的有序度降低;淀粉的相对结晶区提高,无定形峰面积降低。(3)通过转录组分析发现,在osdof18突变体幼苗中涉及氮代谢、氨基酸代谢、代谢途径、植物激素信号转导等信号通路的基因转录水平改变。在RNA测序中发现部分与细胞分裂素通路相关的基因下调表达,在osdof18突变体幼苗中测得细胞分裂素含量上升。进一步对细胞分裂素通路转基因植株进行分析,发现在细胞分裂素通路转基因植株中,旗叶和10DAP籽Infectious illness粒中的细胞分裂素含量显著增加,籽粒蛋白质含量增加,在籽粒淀粉中大颗粒淀粉增多,平均粒径增加。该现象和OsDOF18过表达植株相似,因此推测OsDOF18通过细胞分裂素增大水稻的淀粉粒径。上述研究从农艺性状、生理水平上和分子水平研究了调控水稻根部氮素转运的转录因子OGSKJ4抑制剂sDOF18,并且分析其对水稻籽粒发育和淀粉理化特性的影响,加深了在农业中对氮肥施放的思考,对于水稻高产栽培和品质改良具有重要的理论意义和潜在的实际应用价值,同时为农业绿色高效生产和可持续发展提供了有效途径。

研究背景:脑出血(iHepatocyte-specific genesntracerebral hemorrhage,ICH)是一种常见的脑血管疾病,极高的致死率和致残率使其成为了广大临床工作者所面临的巨大挑战。脑出血后病理进程复杂,神经细胞死亡被认为是脑出血后神经功能缺损的主要因素,但脑出血后神经元死亡的机制目前仍不完全明确,因此对神经元死亡形式及机制的阐明成为了脑出血临床前研究的重要方向。本文旨在明确NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4,Nox4)和转铁蛋白/转铁蛋白受体(Transferrin/Transferrin Receptor,TF/TfR)介导的氧化应激和铁过载在脑出血后神经元铁死亡中的作用及机制,并寻找相关的干预手段,以期减轻脑出血后神经元死亡并改善神经功能预后。研究方法:使用胶原酶注射法构建大鼠脑出血动物模型。Nox4特异性siRNA的体内转染用以敲低Nox4的表达水平、DFO用以抑制脑出血后的铁过载,此外铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1)被用来拯救神经元铁死亡,而氯化亚铁的侧脑室注射被用来诱导脑组织中过量的铁累积。神经功能评分和前肢放置实验用以评估神经功能缺损程度;采用免疫荧光、Western-blot等手段分析Nox4、TF/TfR、兴奋性氨基酸转运蛋白 3(Excitatory Amino Acid Transporter 3,EAAT3)等相关蛋白的表达情况;4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-HNE)等氧化损伤标志物的测定由免疫荧光或免疫组化完成;普鲁士蓝染色分析铁过载情况;焦油紫/快蓝染色评估神经元死亡和组织损伤情况;各类商品化试剂盒测定相关氧化还原产物的水平;透射电镜技术观察铁死亡特征性细胞数量和结构。研究结果:脑出血可以诱导明显的氧化应激和铁过载并导致神经元铁死亡的发生,而Nox4的上调带来的过量过氧化氢(hydrogen JAK/STAT抑制剂peroxide,H2O2)和TF/TfR激活诱导的神经元内铁累积可以介导脑出血后的氧化应激和铁过载的发生。根据芬顿反应原理,上述机制可以诱导脑出血后大量致死性活性氧族(reactiveoxygen species,RIpatasertib采购OS)的产生。此外,脑出血后星形胶质细胞源性谷胱甘肽合成水平上调,而神经元谷胱甘肽耗竭可能与初级脂质过氧化导致的EAAT3表达下调相关。EAAT3表达下调带来的还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)耗竭抑制了 GPX4的表达,这意味着神经元脂质过氧化物清除能力被抑制。上述所有病理进程最终导致了脂质过氧化物堆积造成的不可逆神经元铁死亡的发生。我们的研究发现Nox4的敲低和铁螯合剂DFO的应用可以有效抑制脑出血后的氧化应激和铁过载现象,此外上述干预手段可以抑制脂质过氧化水平并由此恢复EAAT3-GSH-GPX4信号轴的表达,进而挽救脑出血后的神经元铁死亡并改善相应的神经功能缺损症状。研究结论:本研究明确了脑出血后确实存在典型的神经元铁死亡现象,揭示了 Nox4和TF/TfR异常上调介导的氧化应激和铁过载是脑出血后神经元铁死亡的重要分子机制,并表明EAAT3表达下调诱导的GSH缺乏和GPX4抑制是神经元铁死亡的主要原因,而星形胶质细胞源性谷胱甘肽合成能力在脑出血后出现了一定程度的上调。此外,本研究提示Nox4-siRNA及铁螯合剂DFO的应用可以通过缓解氧化应激和铁过载的方式挽救神经元铁死亡并由此改善大鼠脑出血后的早期脑损伤和神经功能预后,侧面支持了相关抗氧化及铁螯合治疗手段及策略的研发必要,并提供了相应的治疗靶标。

背景:庆大霉素(GEN)是一种氨基糖苷类抗生素,在临床上对革兰氏阴性菌引起的感染十分有效。尽管GEN在治疗各种细菌感染方面具有重要作用,但其在使用过程中具有十分严重的肾毒性和耳毒性,目前还没有被批准的针对肾毒性的有效措施。在近些年的许多研究中发现,GEN造成的肾脏损伤过程中存在着多种细胞死亡方式,如细胞坏死、细胞凋亡等,而其主导的死亡方式尚且没有定论。目前在GEN毒性机制的大量研究中发现细胞内氧化/抗氧化失衡、钙离子干扰、钙激活蛋白酶活化等与GEN的毒性密切相关。在本研究中,绿茶中的一种有效抗氧化成分表没食子儿茶素没食子酸酯(EG)被用于减弱GEN造成的肾毒性。并且探讨EG抑制GEN造成的肾脏损伤的主要机制,为GEN的临床安全使用提供保障。方法:在体内实验中,选用SD大鼠作为模型对象,使用GEN以及EG分为四组进行造模:正常对照组;EG组;GEN组;GEN+EG组,首先检测了各组血肌酐、尿素氮水平变化情况,对各组SD大鼠肾脏Hepatitis management功能进行评估;其次通过对各组SD大鼠肾脏组织切片进行病理染色,同时通过透射电镜观察各组SD大鼠肾脏损伤程度以及超微结构变化等,来判断GEN造成肾脏损伤的具体细胞死亡方式以及EG对其的保护作用;最后,检测各组SD大鼠肾脏组织中抗氧化物质谷胱甘肽(GSH)、过氧化物质丙二醛(MDA)以及细胞凋亡、铁死亡标志蛋白水平变化。在体selleck HPLC外实验中,使用GEN对大鼠肾脏细胞52E(NRK-52E)和人肾小管上皮细胞(HK-2)进行造模。检测各组细胞活力变化以及氧化/抗氧化物质水平变化情况。使用GEN刺激NRK-52E细胞,观察细胞中活性氧(ROS)水平随时间变化情况。在蛋白水平检测各组细胞相关指标变化情况。同时,使用小干扰RNA敲低抗氧化蛋白核因子红系2相关因子2(Nrf2)水平,检测氧化/抗氧化物质水平变化,以及细胞凋亡铁死亡标志蛋白水平变化情况。利用分子对接热位移技术对EG抑制GEN造成的肾损伤的具体机制进行研究。最后,利用体外最小抑菌浓度(MIC)试验和抑菌环实验来验证EG对于GEN的抗菌作用是否有影响。结果:体外使用二氢乙啶(DHE)染色实验检测GEN刺激后NRK-52E细胞内ROS含量变化,结果显示GEN刺激早期就可诱导细胞内ROS大量积累,并在1.5H至24H内持续处于较高水平。体内体外检测发现GEN可降低抗氧化物质GSH水平,而EG的使用能够逆转这一现象。而EG能够使GEN造成的过氧化物质MDA水平升高。检测细胞凋亡标志性蛋白Caspase3/C-caspase3、铁死亡标志蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)与SLC7A11水平,发现EG能获悉更多够逆转GEN导致的细胞凋亡与铁死亡。同时,检测抗氧化蛋白Nrf2、血红素加氧酶-1(HO-1)水平,发现EG能够激活Nrf2/HO-1通路并逆转GEN导致的抗氧化蛋白Nrf2/HO-1水平的下降。而在利用小干扰RNA敲低Nrf2水平后,EG丧失了保护GEN造成的肾脏损伤的作用。分子对接与热位移的结果证实EG能够与Nrf2竞争性结合kelch样ECH关联蛋白1(KEAP1),激活Nrf2蛋白。最后,体外最小抑菌浓度(MIC)试验和抑菌环实验表明,EG对于GEN的抗菌效果没有影响。结论:在本研究中,我们证明GEN刺激后,细胞中ROS含量迅速增加,并很快处于异常且稳定的水平。氧化与抗氧化水平的失衡在GEN造成的肾损伤中起到关键性的作用,而抗氧化物质EG的使用能够通过抑制细胞凋亡、铁死亡来保护GEN造成的肾脏损伤。同时研究证明,EG的保护作用是通过激活Nrf2/HO-1通路发挥作用的。并且EG对于GEN的抗菌效果并无影响。

目的:腰椎间盘退变(lumbar intervertebral disc degeneration,LIDD)是临床腰痛主要病因,寻求LIDD的预防及治疗方法具有重大意义。本研究旨在明确1,25(OH)_2D_3在缓解LIDD过程中的作用,并探讨1,25(OH)_2D_3通过抑制腰椎间盘退变髓核细胞(nucleus pulposus Cells,NPCs)铁死亡从而抑制LIDD的机制。方法:培养NPCs细胞,采用不同浓度1,25(OH)_2D_3按不同时间处理NPCs寻找最佳作用浓度和时间,应用铁死亡激动剂Erastin诱导NPCs发生铁死亡。采用Cell Counting Kit-8(CCK8)检测NPCs活力,采用实时定量聚合selleck FUT-175酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)和免疫蛋白印迹法(western blot,WB)检测谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)及维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)的m RNA和蛋白水平。采用RT-qPCR检测SLC7A11和SLC40A1的m RNA表达水平。采用流式细胞术检测细胞内脂质活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,生化试剂盒检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平,通过电镜观察NPCs的线粒体形态变化。结果:1,25(OHTriterpenoids biosynthesis)_2D_3促进NPCs增殖的最佳浓度为10nmol/L,最佳时间Ferroptosis抑制剂为48h。采用10nmol/L 1,25(OH)_2D_3预处理NPCs 48h后再加入Erastin处理,细胞形态和生长状况较Erastin组明显好转,NPCs内GPX4、SLC7A11和SLC40A1的表达、以及SOD、GSH的水平均显著升高,而细胞内ROS和MDA水平显著下降。与空白对照相比,1,25(OH)_2D_3组NPCs内VDR表达明显增多,Erastin组VDR表达明显被抑制,经1,25(OH)_2D_3预处理后部分逆转了VDR表达。在VDR基因沉默后,1,25(OH)_2D_3对Erastin诱导NPCs铁死亡的抑制能力减弱。结论:1,25(OH)_2D_3通过与VDR结合抑制腰椎间盘退变NPCs铁死亡从而抑制LIDD。

目的:构建一种乏氧响应的PLX4032价格纳米载体用于结直肠癌的治疗,联合米托蒽醌和柳氮磺吡啶,考察体外诱导铁死亡和免疫原性死亡的能力,以及体外促进DC细胞和CD8+T细胞的活化的情况;同时体内检测肿瘤渗透深度和联合免疫治疗在结直肠癌上的治疗效果并探索免疫治疗和铁死亡的相关机制,为未来的临床结直肠癌的治疗提供一种新的策略。方法:1.将PEG、多巴胺(Dopamine)和偶氮苯-4,4-二羧酸(Azobenzene-4,4′-dicarboxylic acid,AZO)通过酰胺反应获得乏氧敏感的PEG多巴胺衍生物PAD,以及合成无敏感键的对照组PD,通过核磁共振氢谱验证化合物的合成成功;随后将PD和PAD分别与不同比例的铁、米托蒽醌(MTO)和柳氮磺吡啶(SAS)配位反应获得乏氧响应材料PAD@MS及其对照组PD@MS;通过相关实验对所获得的纳米材料的理化特性进行表征,包括水合粒径、电位、透射电镜、药物释放,材料稳定性等。2.在细胞层面上进行验证,分别在常氧和乏氧的情况下测量不同分组在细胞中的摄取、药物毒性、ROS水平,以及铁死亡的一些表征,包括MDA、GSH、NADPH的含量,SLC7A11、PTGS2、FTL1的蛋白表达,添加各类死亡抑制剂的细胞毒性试验和通过透射电镜反应细胞线粒体的形貌。3.检测在常氧和乏氧下不同处理组细胞中损伤相关分子模式(DAMPs)相关指标,包括CRT、HMGB1、ATP,从而验证其诱导肿瘤免疫原性死亡的能力;通过流式检测DC的活化成熟情况,评估不同分组对DC的激活能力,体外检测不同处理后的DC细胞对CD8+T细胞的活化能力。4.在动物水平通过小鼠活体成像仪检测游离药物、材料PD@MS和PAD@MS在小鼠体内不同时间点的分布情况,通过大鼠眼眶取血检测不同对间点药物在大鼠体内代谢情况,并在C57BL/6和BALB/c小鼠上监测MC38和CT26结直肠癌皮下瘤治疗疗效。存在C57BL/6小鼠上建立结直肠癌肝转移原位模型,并通过治疗观察疗效。5.检测治疗后体内淋巴结、血液、肿瘤中相关免疫细胞如CD4+T、CD8+T、Treg、巨噬细胞、DC细胞的数量水平变化,体内实验中小鼠肿瘤内铁死亡相关指标的水平,以及用ELISA检测体内IFN-γ和immediate range of motionTNF-α的分泌情况。结果:1.核磁共振氢谱结果显示化合物合成成功;测得PD@MS和PAD@MS的水合粒径大概为～130nm,电位～-15mv,PDI～0.2;在常温下有着良好的稳定性。用连二亚硫酸钠(Na2S2O4)模拟乏氧环境,测得材料在乏氧的时候有着更快的药物释放,并且透射电镜也证明了材料在乏氧的时候材料分解的更快这一特性。2.在常氧的情况下,细胞对游离药物M+S的摄取相比于材料组PD@MS和PAD@MS明显增高,考虑是PEG的存在会影响细胞的摄取,在乏氧的时候PAD@MS的摄取明显高于PD@MS,考虑是乏氧的时候乏氧键的断裂使得PEG的脱落,从而减少了抑制摄取的影响。PAD@MS在乏氧条件下有着较高的细胞摄取,可抑制MC38细胞和CT26细胞的增殖,其抗肿瘤作用主要与其成分MTO和SAS有关,Fe3+和MTO可通过增加ROS的产生,SAS可通过抑制GSH的合成,从而引起细胞内氧化还原失衡导致细胞死亡。PAD@MS可通过引起肿瘤细胞发生铁死亡来杀伤肿瘤,可降低细胞膜表面SLC7A11的表达、增加细胞内ROS的产生,降低细胞内GSH和NADPH的含量,从而引起氧化还原失衡,引起脂质过氧化物MDA和蛋白PTGS2表达增高;同时细胞线粒体电镜也有着线粒体膜密度增高,外膜断裂,内膜消失等铁死亡特征。添加各种死亡抑制剂的细胞毒性实验结果显示PAD@MS引起的细胞死亡可被铁死亡抑制剂在一定程度上的逆转,证明PAD@MS可通过引起肿瘤细胞发生铁死亡。肿瘤细胞发生免疫原性死亡的时候会释放点击此处一些免疫原性物质,如CRT、HMGB1、ATP等,这些物质可用来诱导DC细胞的活化成熟。实验结果表明PAD@MS在乏氧条件下引起DAMPs的释放更多,从而更能促进DC细胞的活化成熟。另外乏氧时CD44和CD69在CD8+T细胞表面上的表达显著增高。同时,细胞内和分泌的IFN-γ也显着增加。乏氧PAD@MS组的CD8+T细胞数量也有明显增殖。以上结果都证实了 PAD@MS可以明显提高MC38细胞的免疫原性,通过使DC成熟,进而激活CD8+T细胞的细胞杀伤作用。3.与游离药物组相比,PD@MS组和PAD@MS组均可显著增加药物在血液中的有效药物浓度且在血液中稳定性良好,有利于药物持续递送到肿瘤部位。相比于游离药物在体内的被快速代谢且在肿瘤内蓄积低,PAD@MS组有着很好的肿瘤蓄积能力,并且延长了药物在体内的循环时间,展现出优异的肿瘤内蓄积能力。PAD@MS在体内有着很好的肿瘤渗透能力,可以达到远离血管的深部肿瘤组织,可能是因为PAD@MS在肿瘤乏氧微环境分解成小分子颗粒,从而促进其渗透能力。4.在MC38荷瘤C57BL/6小鼠和CT26荷瘤BALB/c小鼠体内,PAD@MS能有效抑制结直肠癌的生长和延长小鼠的生存期,与α-PD-L1联用后效果显著增强,两者具有协同作用。PAD@MS处理组的小鼠血液、淋巴结和肿瘤中的DC细胞和巨噬细胞比例均有升高,可以通过抗原提呈促进T细胞的活化成熟—同时,巨噬细胞的表型更趋向于杀伤肿瘤的M1表型,可以分泌血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)杀伤肿瘤。DC细胞和巨噬细胞抗原提呈促进了 T细胞的活化成熟,同时也增加了血液、淋巴结和肿瘤中的CD4+T和CD8+T细胞比例,并降低了 Treg T细胞的含量,增强了抗肿瘤免疫应答,使得免疫激活比免疫抑制作用更强,使“冷”肿瘤变成了“热”肿瘤,进而重新编辑了肿瘤微环境。在机制上来说,CD8+T细胞分泌的IFN-γ可以通过降低细胞表面的SLC7A11表达,从而进一步加剧肿瘤细胞内氧化还原失衡进而促进肿瘤细胞发生铁死亡来杀伤肿瘤。PAD@MS治疗后未引起明显的组织器官病理学改变,并且拥有着宽泛的治疗窗,肝肾功能指标均未引起明显改变,可认为其是安全的,有转化价值的纳米药物。结论:具有乏氧响应型的PAD@MS赋予了纳米材料在血液循环中避免被清除并保持完整,通过减少正常组织暴露于铁死亡诱导剂来最大程度地减少副作用。到达肿瘤组织后,PEG响应乏氧肿瘤微环境而与纳米颗粒急剧解离,以促进药物的释放和肿瘤对药物的内吞,粒径减小的材料可帮助药物到达更深部的肿瘤位置。我们构建的PAD@MS纳米材料可以有效的通过诱导肿瘤细胞发生铁死亡和免疫原性死亡,发挥化疗协同免疫激活的作用,当与抗PDL1抗体(α-PD-L1)联合使用时,基于纳米颗粒的铁死亡诱导有效地抑制了肿瘤的生长,并通过增强更强的免疫应答显著延长了荷瘤小鼠的存活时间。目前我们的工作证明了通过肿瘤特异性铁死亡诱导对抗免疫抵抗的可行性,这种简单、可控和可扩展的纳米平台在铁死亡驱动的免疫治疗的临床转化中显示出广阔的潜力。

黑枸杞(Lycium ruthenicum Murr.)是茄科枸杞属多年生灌木,广泛分布于青海、新疆和甘肃等沙漠盐碱地区,是西部地区重要的药用植物资源和经济作物。黑枸杞富含多酚、黄酮和花青素等多种次生代谢物,对人体抗氧化等具有显著效果。近年来黑枸杞果实化学成分和生物活性研究成为热点,研究表明黑枸杞分布区域生态环境差异很大,且不同产地黑枸杞果实在营养成分及含量上都有差异。通过比较不同产地黑枸杞组分差异,并揭示组分代谢差异产生RAD001 NMR的潜在机制,有利于黑枸杞品种改良及药用成分资源利用。此外,深入研究黑枸杞果实多糖、多酚等功能性组分的胃肠道吸收代谢模式及改善肠道健康的作用机制将有助于合理利用黑枸杞药用及保健价值。1.以青海、内蒙古、甘肃、宁夏、新疆5个产地的黑枸杞果实为研究对象,系统测定5个产地黑枸杞果实粗多糖理化性质,结果表明5产地黑枸杞粗多糖单糖组分相同,而青海黑枸杞中总糖含量(47.47±0.34%)最高。分析黑枸杞总多酚、总黄酮、总花色苷含量发现,青海黑枸杞总多酚(36.78±0.38 mg/g DW)及总黄酮含量(25.55±0.28 mg/g DW)高于它4个产地黑枸杞。评估比较5产地黑枸杞果实购买PLX5622粗多糖和粗多酚体外抗氧化能力,发现青海黑枸杞果实粗多酚的DPPH(IC50=0.062±0.013 mg/mL)、ABTS+(IC50=0.218±0.039mg/mL)自由基清除能力最强。结合H2O2氧化损伤的Raw264.7细胞模型评估5产地粗多酚的细胞抗氧化能力,发现青海黑枸杞果实粗多酚能显著缓解H2O2对Raw264.7细胞造成的增殖抑制、减少细胞凋亡及ROS产生、上调抗氧化酶基因表达,下调炎症因子基因表达。以上结果表明青海黑枸杞果实含有更多抗氧化活性成分。2.为进一步挖掘5产地黑枸杞果实的差异活性化学组biogas upgrading分,借助代谢组分析5产地黑枸杞果实代谢谱,发现5个产地黑枸杞果实共有197种差异代谢物,其中16种有机酸及其衍生物、16种碳水化合物、25种苯丙素、12种花青素、33种类黄酮、24种生物碱、6种萜烯、7种维生素及其衍生物、14种氨基酸及其衍生物、16种类固醇,黑枸杞代谢成分具有地区差异性。富集分析差异代谢物发现,青海黑枸杞果实中多种苯丙烷及黄酮类化合物含量显著高于其他4个产地,其中10个上调代谢物与黑枸杞抗氧化活性显著相关。体外验证结果表明10个代谢物可有效清除DPPH(IC50范围为6.237～0.001 mg/mL)和 ABTS+(IC50 范围为 0.048～0.001 mg/mL)自由基,其中山奈酚-3-O-芸香苷和槲皮素-3-O-芸香糖苷的两种自由基清除IC50=1 μg/mL,抗氧化活性最强。转录组分析表明,参与类黄酮、苯丙素和花青素生物合成的基因在青海黑枸杞果实中的表达水平显著高于其他产地的黑枸杞。结合枸杞基因组数据,鉴定LrFLS和LrCYP75B1是编码山奈酚-3-O-芸香糖苷和槲皮素-3-O-芸香糖苷合成的限速基因。RT-qPCR定量结果显示,LrFLS和LrCYP75B1在青海黑枸杞成熟期和着色期均处于较高表达水平,且比其他4产地表达量约高4倍。通过在黑枸杞叶片中过表达LrFLS和LrCYP75B1发现,过表达LrFLS和LrCYP75B1可增加黑枸杞叶片中山奈酚-3-O-芸香苷和槲皮素-3-O-芸香糖苷的3倍含量,并提高黑枸杞提取物的体外抗氧化活性。上述结果表明,青海黑枸杞富含黄酮类代谢物,其中山奈酚-3-O-芸香苷和槲皮素-3-O-芸香糖苷两种黄酮物质的合成积累是青海黑枸杞高抗氧化活性的重要原因。3.为解析青海黑枸杞果实中山奈酚-3-O-芸香苷和槲皮素-3-O-芸香糖苷的生物合成转录调控机制,利用黑枸杞不同发育时期转录组数据,构建黑枸杞中2个代谢物合成基因的调控网络。借助ChIp-qPCR、酵母单杂、LUC和EMSA等技术确定LrMYB94和LrWRKY32分别通过直接结合LrFLS和LrCYP75B1的启动子来激活黑枸杞中山奈酚-3-O-芸香糖苷和槲皮素-3-O-芸香糖苷的合成。通过构建稳定过表达LrMYB94或LrWRKY32的黑枸杞愈伤组织,发现过表达LrMYB94或LrWRKY32可激活LrFLS和LrCYP75B1的表达,提高山奈酚-3-O-芸香苷和槲皮素-3-O-芸香糖苷含量,最终增强黑枸杞抗氧化活性。以上结果揭示了青海黑枸杞果实中关键抗氧化活性成分的转录合成调控机制。4.为了研究青海黑枸杞功能性组分(粗多糖、多酚、花色苷)在人体的消化吸收特征,构建体外胃肠道消化模型。结果表明黑枸杞果实多糖在胃肠消化后还原性糖从0.396±0.056 mg/mL增加为0.626±0.032 mg/mL,在多糖消化过程中未检测出游离单糖;果实多酚在胃肠消化后总多酚含量分别降低19.96%和21.01%,总黄酮分别降低16.60%和33.02%,且多酚粗提物代谢成分发生显著变化,胃肠消化后代谢物与肠道慢性疾病相关。通过大孔树脂纯化粗多酚,得到主要含有4种矮牵牛素和1种锦葵色素衍生物的纯化花色苷,其经胃肠消化后总花色苷含量降低11.3%。采用体外模拟研究青海黑枸杞功能性组分对肠道功能的作用,发现黑枸杞多糖可延缓葡萄糖的扩散,功能性组分均能抑制α-淀粉酶、胃蛋白酶、胰脂肪酶3种胃肠道主消化酶酶活,具有胆酸盐结合能力。上述结果说明青海黑枸杞多种活性成分可在胃肠中被少量吸收后改善肠道功能。5.为了探究青海黑枸杞功能性组分对肠道健康的影响,利用4%DSS自由饮用方式构建结肠炎模小鼠。进一步对结肠炎小鼠进行黑枸杞功能性组分灌胃处理后,检测小鼠各项病理指标。结果表明,黑枸杞功能性组分(粗多糖、多酚、花色苷)干预能减缓DSS引起的体重骤减、粪便便血、结肠缩短、DAI评分降低等发病症状,改善结肠炎小鼠结肠组织损伤及免疫器官指数上升。Elisa和PCR结果表明,黑枸杞功能性组分可通过降低促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α的水平,有效减轻结肠炎相关炎症反应。同时,功能性组分降低氧化应激标志物MDA(65.89%)、MPO(49.50%)和H2O2(86.20%)的水平,增加抗氧化酶SOD(65.5%)、CAT(79.41%)和GSH-Px(53.44%)的表达,减轻结肠炎相关氧化应激反应。利用16S测序发现,黑枸杞功能性组分有助于恢复结肠炎模型小鼠紊乱的肠道菌群,并提高增加有益菌Lactobacillus、Lachnospira的丰度,减少有害菌Alloprevotella、Parabacteroides。此外,青海黑枸杞功能性组分对肠上皮细胞(IPEC-J2)无显著细胞毒性、小鼠主要器官HE染色无明显病理特征、血常规检测正常。上述结果表明青海黑枸杞功能性组分具有改善炎症性结肠的功能。本研究通过比较不同产地黑枸杞果实代谢差异,结合代谢组与转录组系统研究黑枸杞果实核心差异功能性组分的形成机制,为改良黑枸杞药材品质提供科学依据。进一步借助体外胃肠道消化模拟系统,探究黑枸杞主要功能性组分在胃肠道中的消化吸收模式,结合结肠炎小鼠模型研究黑枸杞功能性组分在体内改善肠道健康的作用机制,为后续深度开发黑枸杞药用及保健功能提供理论依据。

为了提高羊肉香肠的食用品质，降低产品的膻味，该研究采用乳酸菌和酵母菌复配发酵，探究菌株的协同作用对羊肉香肠食用品质的影响以及对最终成品膻味的脱除效果。该研究将前期从羊肉香肠GDC-0973 IC50中筛选得到的戊糖片球菌L7和近平滑假丝酵母Y22以2:1的比例复配发酵生产羊肉香肠，以不接种和单菌接种为对照组，分析了羊肉香肠的基本理化指标、感官品质、游离脂肪酸、挥发性物质和生物胺含量。实验结果显示复配接种组羊肉香肠的感官评分总分为88.5分，显著高于不接种组的69.5分（P＜0.05）。羊肉香肠成品中，复配接种组的挥发性物质种类更多，共检出91种。相比3个对照组，复配接种组羊肉香肠的膻味最弱，与羊肉膻味相关的肉豆蔻酸相较于不接种组降低了6.54％、棕确认细节榈酸降低了10.45％、硬脂酸降低了40.61％、油酸降低了17.55％。该研究表明，Small biopsy乳酸菌和酵母菌复配接种发酵能够降低羊肉香肠的膻味，提高羊肉香肠的可接受度，提升羊肉香肠的食用品质。