S6 kinase 信号通路

糖苷酶(Glycoside hydrolases,GHs)可催化糖苷的水解或转苷反应,其催化转苷反应时不依赖磷酸化糖,因此可在体外实现糖苷的酶法合成。然而,大部分GHs同时催化水解和转苷反应,由于水解反应的存在,糖苷产物得率普遍不高。因此,研究GHs的水解和转苷反应的选择性机制,实现定向转苷,对糖苷合成具有重要意义。此外,因为糖苷键的类型对糖的结构与功能起决定作用,GHs催化转苷反应时的糖苷键类型的选择性,亦是糖苷合成的重要研究内容。GHs催化水解或转苷反应时会生成一种糖-酶结合过渡态(TS)结构,该结构的自由能垒高低可决定GHs水解/转苷的偏好性,然而TS结构难以通过实验捕获,TS结构的确定是GHs水解/转苷机制研究的难点和关键点。多尺度理论模拟可对GHs催化反应机理进行建模从而获得关键TS结构。α-糖苷酶在食品加工领域应用广泛,但目前的机制研究主要集中在β-糖苷酶,对α-糖苷酶的机理研究较少。本论文采用多尺度理论模拟方法对α-糖苷酶中有代表性的GH29家族的Lactobacillu此网站s casei来源岩藻糖苷酶Alf C的水解偏好性机理、GH77家族Thermus aquaticus来源的淀粉麦芽糖酶Ta AM的转苷偏好性机理进行解析,在此基础上根据影响水解与转苷偏好性的关键位点分布特征,对蔗糖水解酶和淀粉蔗糖酶进行分子改造实现了的水解/转苷定向调控,并通过多尺度理论模拟对其选择性机制进行解析。此外,还对Limosilactobacillus reuteri 121来源的4,6-α-葡聚糖转移酶Lr Gtf B的转苷键型的偏好性机理进行解析。主要研究结果如下:(1)GH29家族岩藻糖苷酶Alf C的水解偏好性机理研究。针对酸碱催化剂构象未被正确定位的问题,采用加速分子动力学模拟对酸碱候选残基D242所在loop进行构象采样,确定D242为酸碱催化剂,并捕获其可催化构象。QM/MM元动力学模拟结果表明Alf C糖基化反应,水解反应和转苷反应的自由能垒分别为16.1 kcal·mol~(-1)、9.8 kcal·mol~(-1)和11.4 kcal·mol~(-1),故Alf C为水解偏好性GHs。此外,还确定了三者的构象路线分别为~1C_4→[~3H_4]~(?)→~1C_4、~3S_1/~3H_4→[~3H_4/E_4]~(?)→~1C_4和~3S_1/~3H_4→[E_4]~(?)→~1C_4。通过分析水解和转苷反应TS结构,发现转苷TS结构D242的羧基O_(δ2)原子与受体糖环的O5原子的距离比水解反应中更近,两者之间具有静电排斥作用,这是Alf C水解偏好性的关键因素,从而导致转苷反应自由能垒比水解反应的高。(2)GH77家族淀粉麦芽糖酶Ta AM转苷偏好性机理研究。针对糖链距离酸碱残基E340远,质子转移不清晰及后续催化的问题,提出由250s loop介导的构象开关模型。路径-元动力学模拟表明糖链存在与否会使250s loop分别处于关闭(C)和开放构象(O),且C构象比O构象的能量高4.0 kcal·mol~(-1)。250s loop处于C构象时可诱导糖链发生滑动,使糖苷氧原子靠近酸碱残基E340催化糖基化反应,总自由能垒为12.9 kcal·mol~(-1)。此外,250s loop在水解和转苷时分别处于部分关闭(PC)和C构象。QM/MM元动力学结果表明水解和转苷反应的自由能垒分别为18.0 kcal·mol~(-1)和9.0 kcal·mol~(-1)。因此,转苷的整体能垒比水解低5.1 kcal·mol~(-1),与转苷/水解比5000:1的实验结果一致。分析水解和转苷反应TS结构发现,由于转苷反应的250s loop处于C态,活性位点的堆积比较紧密,TS比较稳定;而水解反应的250s loop处于PC态,活性位点堆积比较松散,TS不稳定。因此构象动力学诱导的过渡态能量差异是Ta AM为转苷偏好性GHs的重要因素,这与250s loop周围残基突变导致歧化/水解比值降低的实验结果一致。(3)GH13家族蔗糖水解酶SHs和淀粉蔗糖酶ASs水解和转苷的定向调控。蔗糖水解酶SHs和淀粉蔗糖酶ASs是GH13家族中序列、结构相似的两类酶,分别偏好水解和转苷反应。根据揭示的GHs水解与转苷偏好性关键位点分布特征,通过序列比对和结构分析发现两种酶亲核残基D邻位存在保守的氨基酸S(位于SHs)和A(位于ASs)。在两类酶中分别选取Xanthomonas axonopodus来源的Xa SH、Caulobacter crescentus来源的Cc SH和Neisseria polysaccharea来源的Np AS、Deinococcus geothermalis来源的Dg AS进行定点突变研究。Xa SH_(S281A)和Cc SH_(S271A)的T/H(转苷/水解产物比)由野生型的0.05和0.07分别增加到1.4和1.11,Np AS_(A287S)和Dg AS_(A285S)的T/H比由野生型的8.80和7.13分别下降到0.15和0.20,动力学数据亦表明,Xa SH_(S281A)和Cc SH_(S271A)由野生型的水解偏好变为转苷偏好,Np AS_(A287S)和Dg AS_(A285S)由野生型的转苷偏好变为水解偏好,并得到了HPLC、HPAEC-PAD和~1H NMR等实验结果支持。(4)GH13家族蔗糖水解酶SHs和淀粉蔗糖酶ASs水解和转苷选择性机理研究。选取具有高分辨率结构的水解酶Xa SH、转苷酶Np AS及其突变体为研究对象。MD模拟结果表明www.selleck.cn/products/INCB18424Xa SH、Np AS_(A287S)的S与亲核试剂D之间具有氢键作用,可导致受体糖分子的位置偏移,使水分子更容易渗透到活性位点发生水解反应。此外,该氢键降低了亲核试剂的p K_a值,可促进糖苷键断裂。QM/MM元动力学模拟结果表明XaEnzyme Assays SH、Xa SH_(S281A)、Np AS、Np AS_(A287S)水解反应自由能垒分别为10.3、13.5、8.9和7.1 kcal·mol~(-1),转苷反应的自由能垒分别为20.3、9.6、8.2和9.6 kcal·mol~(-1),与实验结果一致。分析转苷TS结构发现,当存在氢键时,+1亚位点糖环构象偏移,与-1亚位点糖环产生空间位阻,转苷反应自由能垒高于水解反应;反之,不存在该氢键时,则不存在位阻效应。由氢键作用引发的位阻效应是ASs/SHs是转苷/水解偏好的关键因素。(5)GH70家族Lr Gtf B的α-1,6/α-1,4键型选择性机理研究。QM/MM元动力学模拟结果表明Lr Gtf B糖基化反应为12.2 kcal·mol~(-1);以异麦芽糖为受体时α-1,6和α-1,4转苷反应自由能垒分别为6.7 kcal·mol~(-1)和22.3 kcal·mol~(-1);以麦芽糖为受体时α-1,6和α-1,4转苷反应自由能垒分别为11.7 kcal·mol~(-1)和14.8 kcal·mol~(-1),故Lr Gtf B为α-1,6转苷反应偏好性GHs。此外,分析转苷TS结构发现,+1亚位点上方的loop B具有可塑性,可被α-1,6成键时+1亚位点糖单元定向诱导,导致loop B上的T920的疏水甲基朝向+1亚位点移动,进而稳定糖环构象,促进α-1,6转苷反应。而在α-1,4转苷反应时,由于K1128和+1亚位点糖单元之间的氢键作用限制了+1亚位点糖单元构象空间,导致+1与-1亚位点之间的糖单元间产生空间位阻,从而不利于α-1,4转苷反应。

目的 探讨miR-187-3p对破骨细胞增殖、3-Methyladenine体内实验剂量凋亡、分化的影响及其对叉头框转录因子(FOX)K1/核因子(NF)-κB信号通路的调控作用。方法 选取49例骨质疏松(OP)患者为OP组，同时选取绝经后骨质疏松性无骨折患者49例为control组；18只SPF级雌性大鼠，分为正常组与模型组，每组9只；原代分离培养OP大鼠破骨细胞，miR-NC、miR-187-3p mimics、pcDNA-NC、pcDNA-FOXK1、miR-187-3p mimics与pcDNA-NC、miR-187-3p mimics与pcDNA FOXK1转染入破骨细胞；采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)与Western印迹分别检测OP患者血清与破骨细胞中miR-187-3p、FOXK1的表达量；采用qRT-PCR法检测破骨细胞中耐酒石酸酸性磷酸酶(Acp)-5、基质金属蛋白酶(MMP)9、组织蛋白酶(Cathepsin K)、整合素(Integrinαv)的表达量；采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞活力；采用流式细胞术检测细胞凋亡率；双荧光素酶报告基因实验检测miR-187-3p与FOXK1的靶向关系；Wsternal wound infectionestern印迹检测Ki-67、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved-caspase)-3、p-p65、p-核因子κB抑制蛋白(IкB)α蛋白表达量。结果 与control组比较，OP组血清中miR-187-3p表达水平明显降低，FOXK1表达水平明显升高(均P<0.05);与正常组比较，模型组miR-187-3p表达水平明显降低，FOXK1表达水平明显升高(均P<0.05);与miR-NC组比较，miR-187-3p组细胞活力明显降低，细胞凋亡率明显升高，Ki-67、Acp-5、MMP9、Cathepsin K、Integrinαv、p-p65、p-IкBα表达水平明显降低，Cleaved-caspase-3蛋白水平明显升高(均P<0.05);与pcDNA-NC组或miR-187-3p+pcDNDibutyryl-cAMP使用方法A-NC组比较，pcDNA-FOXK1组或miR-187-3p+pcDNA-FOXK1组细胞活力明显升高，细胞凋亡率明显降低，Ki-67、Acp-5、MMP9、Cathepsin K、Integrinαv、p-p65、p-IкBα表达水平明显升高，Cleaved-caspase-3蛋白水平明显降低(均P<0.05);双荧光素酶报告基因实验证实FOXK1是miR-187-3p的靶基因。结论 miR-187-3p过表达可通过下调FOXK1的表达从而抑制破骨细胞增殖、分化及促进破骨细胞凋亡，其作用机制与抑制NF-κB信号通路的活化有关。

食物过敏是过敏性流行病之一,仅次于哮喘病,影响着全球2%～4%的成人和儿童的健康和生命。八大类常见食物过敏原有大豆、花生、小麦、坚果、牛奶、鸡蛋、甲壳类、鱼类,其中水产品占据两类。作为广受青睐的甲壳类水产品,三疣梭子蟹与其他软体类、甲壳类动物存在较强的过敏原交叉反应,其中不耐热且不耐强酸的精氨酸激酶(AK)是主要过敏原之一。同时,作为一种糖蛋白,其致敏性的研究备受关注。引起食物过敏的物质大多是糖蛋白,为探究糖基化修饰对过敏蛋白致敏性和致敏程度的影响,本文在制备和纯化了梭子蟹AK的基础上,对AK结构进行鉴定,并利用生物信息学技术预测和体外实验验证的方法,从结构层面阐释了糖基化修饰对梭子蟹AK致敏性的影响,为梭子蟹及其他水产品的降敏研究提供了理论基础和数据支持。论文主要结论如下:1、从三疣梭子蟹蟹肉中分离获得梭子蟹精氨酸激酶(AK)粗提物,通过SDS-PAGE凝胶电泳发现分子量约为40 KDa的条带,与多篇研究发现的AK相似。为得到纯的过敏原AK,利用制备型电泳进一步分离纯化,为后续的蛋白鉴定、糖基化修饰以及AK致敏性的探究提供了高纯度的样品。经胶内酶切,利用蛋白质组学和液质联用技术鉴定到高覆盖率的精selleckchem S63845氨酸激酶,确认此纯化样品即为三疣梭子蟹过敏原AK。本文利用蛋白质组学方法和LC-MS/MS技术,从特征肽段出发鉴定得到梭子蟹过敏原AK,并对AK的糖基化修饰进行结构表征,为食物过敏原标签规范化提供了重要的基础数据。2、以三疣梭子蟹过敏原AK为研究对象,计算了AK的理化性质,预测了AK的抗原表selleck激酶抑制剂位。结果表明,与三疣梭子蟹AK具有高度序列同源性的是蓝蟹、中华绒螯蟹等节肢动物的AK;三疣梭子蟹AK的B细胞线性抗原表位为39～44、87～103、174～181、309～317、326～330,T细胞线性抗原表位为18～22、52～55、174～175、193～195、229～232、276～277、299～300、345～351,且三疣梭子蟹AK的_(174)Thr-Lys_(175)均出现在B细胞和T细胞抗原表位预测位点,推测174位苏氨酸、175位赖氨酸在免疫原性中起重要作用。利用SWISS-MODEL、Discovery Studio和ZDOCK SERVE进行同源建模和分子对接。c Dock对接结果表明,相较于其他抗过敏药物,梭子蟹AK与西替利嗪的对接互作结合能最高,预测其对由梭子蟹AK引起的食物过敏有更好的降敏效果。西替利嗪主要通过与AK上Arg、Glu和Thr贡献的氢键、离子键亲和结合,推测西替利嗪与AK的结合掩蔽了AK的B细胞线性抗原表位和构象表位,进而降低了致敏蛋白与免疫球蛋白结合的可能性,达到抗过敏的效果。肥大细胞(Mast cell,MC)是过敏的关键驱动因子之一,肥大细胞的相关G蛋白偶联受体可介导MC活化。ZDOCK对接结果显示,无糖基化AK主要通过Tyr134、Ser150、Gly165的氢键和Phe168、Phe186的π-π相互作用与Mrgprb2结合,激活肥大细胞,引发过敏反应。单个糖基化修饰增强了AK的致敏性,但与无糖基化相比并无显著性差异,推Biomacromolecular damage测糖基化修饰会增强AK的致敏性,糖链对AK致敏性的关键作用在于修饰位点,其次是糖基的数量和糖型结构。3、为探究糖基化对AK致敏程度的影响,利用P815肥大细胞脱颗粒实验的组胺释放量和β-氨基己糖苷酶释放量,验证AK致敏性机理的推测。结果表明,过度糖基化对AK致敏性的影响不确定,因而美拉德反应可能无法应用于消减梭子蟹AK致敏性;相较于去糖基化AK,仅去除N-糖链的AK表现出更强的致敏性,这与ZDOCK蛋白对接的结果相一致,猜测是N-糖链的去除暴露了与O-糖链息息相关的构象抗原表位和线性抗原表位;相较于天然AK,仅去除O-糖链的AK表现出更弱的致敏性,猜测是因为破坏了与O-糖链相关的构象抗原表位,以及N-糖链仍掩蔽线性抗原表位的结果。因而,得到了一个推测:O-糖链在构象抗原表位中起重要作用,N-糖链可能会掩蔽线性抗原表位,这给降低梭子蟹AK致敏性的研究提供了一个新思路。

目的 了解湖南省不同类别市售食品中单核细胞增生李斯特菌（LM）的污染状况，为食源性疾病防控和食品安全监管提供依据。方法 2014—2021年在全省14个市州的餐饮环节和流通环节随机抽取15类12 046份食品样品开展LM检测，用SPSS 22.0软件对城市和农村地区不同食品特征的LM污染状况进行描述性分析。结果 采集的12 046份市售食品样品，检出LM阳性297份，总检出率为2.47%；各季度间的LM检出率差异有统计学意义（χ2=15.635,P=0.001），第二季度的检出率（3.24%）最高，是其他季度总检出率的1.6倍（95%CIPCR Genotyping:1.246～1.983,P<0.001）；散装食品LM检出率高于预包装食品，差异有统计学KD025抑制剂意义（χ2=18.652,P<0.001）。城市地区不同类别食品中食用菌及其制品的检出率（9.17%）最高，是其他类别食品总检出率的4.1倍（95%CI:2.168～7.674,P<0.001），其次为肉及肉制品（7.13%）和速冻米面食品（3.74%）；农村地区LM检出率前3位的食品依次为食用菌及其制品（44.44%）、速冻米面食品（5.88%）、肉及肉制品（4.48%）。在肉及肉制品中，预制肉制品和冷冻畜肉LM污染风险是熟肉制品的52.5倍和36.1倍（95%CI分别为25.612～107.504、13.580～96.135,P<0.001）。此外，该菌在流通环节的食品中检出率高于餐饮服务环节（χ2=5Canagliflozin分子式6.654,P<0.001），其中批发市场食品检出率最高（11.54%），污染风险是其他场所的5.2倍（95%CI:1.553～17.423,P=0.025）。结论 湖南省市售食品中存在LM污染，尤其食用菌和预制肉制品的污染程度较高。

作为世界第二大作物,小麦是世界上近40%人口的主食,为人类提供了约20%的热量和蛋白质。近年来,提高小麦产量仍然是我们目前面临的最大挑战之一。根据中国农业农村部的报告,尽管小麦单产呈上升趋势,但近年来中国进口小CP-690550价格麦总量呈上升趋势。与此同时,中国小麦的出口量变化不大,在过去的十年里,小麦的年出口量不到500万吨,与早些时候相比有所下降。预计未来十年VX-765体外,中国小麦生产和消费之间的差距将逐渐扩大。分析高产小麦的遗传基础,实施高产分子育种,是保障国家粮食安全的重要支柱和保障。目前,小麦的育种方法主要基于传统的育种技术,由于其周期长、效率低,无法满足人们的生产需求。随着基因组学和分子生物学的发展,分子育种技术与传统育种技术相结合,在小麦育种中受到重视,它可以显著缩短育种时间,提高育种的遗传效益。miRNA在植物的生长、发育和逆境胁迫应答等生物学过程和农艺性状控制上都起着重要作用。其中,miR159是一个比较古老的基因,存在于大多数陆生植物中。它通过一个高度保守的miR159结合位点靶向一类称为GAMYB或GAMYB-like的调控基因来影响小麦的生长发育,miR160作为植物miRNA家族成员之一,在拟南芥、番茄、苹果等植物中均有报道,其表达受光、植物激素等多种因素的影响。之前有研究表明miR160的靶基因为生长素响应因子ARF家族成员,其通过调控靶基因从而影响小麦生长发育。主要研究内容如下:1.本试验解析了miR1solid-phase immunoassay59和miR160基因在基因组上分布规律,在小麦基因组中分别有11个和6个基因家族,分别有9个和3个位点。2.利用结合了高通量测序技术与生物信息学分析各自的优势的降解组测序技术的方法,发现并验证了小麦的miR159基因的靶基因和小麦miR160基因的靶基因。此外解析了miR159的靶基因MYB家族在小麦基因组中的分布规律。3.利用CRISPR/Cas9技术,创制了小麦miR159和miR160基因编辑突变体。4.通过对突变体植株的表型调查,发现小麦miR159和miR160基因对小麦的根系生长和细胞发育有着一定影响,此外这两个miRNA对小麦的植株高度、植株节长、旗叶发育、穗的发育、分蘖数等均有一定程度的影响。5.通过转录组测序,发现了突变体植株的大量差异表达基因。通过对基因的GO功能富集分析发现miR159和miR160都参与了小麦的光合和线粒体的能量反应过程,此外miR160还参与了信号转导过程。

目的 探讨不同颈内静脉隧道式导管封管液对预防维持性血液透析(MHD)患者导管相关性血流感染(CRBSI)、导管功能不良的影响。方法 选取2020年1月～2021年7月在本院接受治疗的MHD患者100例，采用随机数表法分为A组(35例)、B组(31例)、C组(34例)。其中A组患者给予肝素钠盐水封管，B组患者采用定期尿激酶、肝素联合Toxicogenic fungal populations封管，C组患者采用4%枸橼酸钠封管，记录并对比3组患者的CRBSI、栓塞发生情况以及其他相关指标https://www.selleck.cn/products/smoothened-agonist-sag-hcl.html。结果 3组患者的一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05),A组导管栓塞率均高于B、C组(P<0.05),3组患者耳鸣、低血压差异无统计学意义(P>0.05)。相较于透析前，3组透析后的凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(aPTT)、凝血酶时间(TT)差异均无统计学意义(P>0.05),且3组同一时间的以上凝血功能指标差异均无统计学意义(P>0.05)。A组患者尿素清除指数(Kt/V)、导管有效血流量均低于B、C组，A组导管使用时间长于B、C组(P<0.05),B、C组间以上指标差异均无统计学意义(P>0.05)。3组患者治疗后2、4个月的无CRBSI生存率差异均无统计学意义(P>0.05),AY-27632组治疗6个月无CRBSI生存率低于B、C两组(P<0.05)。结论 肝素钠盐水、定期尿激酶联合肝素、4%枸橼酸钠均可作为MHD患者颈内静脉隧道式导管封管液，但定期尿激酶联合肝素以及4%枸橼酸钠可以降低CRBSI以及导管功能不良的发生风险，且相较于肝素钠盐水封管可以延长导管使用寿命。

抗生素在临床医学和畜禽养殖业中的大量使用与细菌耐药性的增加已形成一种恶性循环,导致多重耐药菌的产生和流行。碳青霉烯类药物是治疗多重耐药菌感染最重要的抗生素,但多种革兰氏阴性菌如假单胞菌(Pseudomonas)已对其产生耐药性。Pseudomonas是环境中常见的条件致病菌,其中铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)可导致呼吸机相关肺炎和囊性纤维化等多种疾病,严重威胁人类健康。Pseudomonas通过分泌碳青霉烯酶水解相应的药物,这类耐药基因往往都是由可移动元件携带,通过基因的水平转移扩大传播范围,加快传播速度,同时新型抗生素研发缓慢,使得治疗该菌感染的难度加大。为此,研究人员提出抗生素协同剂的治疗策略,该策略可提高抗生素对耐药菌感染的治疗效果,降低抗生素的开发成本。食物中提取的天然化合物具有毒副作用小,不易诱导细菌耐药,可以长期食用等优势,将其开发为抗生素协同剂对于耐药菌的防治具有重要意义。本研究鉴定了 40株耐碳青霉烯假单胞菌(carbapenem-resistant Pseudomonas,CRP)对20种抗生素的敏感性,通过二代、三代测序技术相结合的方法获得细菌的遗传序列信息,对携带碳青霉烯酶基因的外源遗传元件(accessory genetic elements,AGEs)内部的精细结构及进化关系进行解析,探讨其在介导耐药基因传播过程中所发挥的作用,并从484种药食同源中药单体化合物中发掘新型碳青霉烯类药物协同剂,探究其作用机制。主要内容及结果如下:以分离自吉林省的40株CRP菌株为试验对象,采用BD Phoenix~(TM) 100微生物全自动分析仪鉴定菌株的物种信息及其对20种抗生素的耐受性,利用二代高通量测序技术对菌株进行测序并获得细菌基因组框架图,通过生物信息学对菌种进行精确鉴定,筛查其携带的耐药基因情况,通过系统发育树分析菌株的变异情况及遗传进化关系。结果表明,共鉴定到39株耐碳青霉烯铜绿假单胞菌(carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa,CRPA)和 1 株耐碳青霉烯P.juntendi菌株(carbapenem-resistant PseudINCB018424omonas juntendi,CRPJ),对其中13种受试抗生素的耐药率大于95%,IP对3株CRPA的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)为 4,096 μg/mL。使用耐药基因数据库 ResFinder 和 CARD对40株CRP进行筛查,共发现27种外源耐药基因,有6株菌携带3种外源碳青霉烯酶基因(bla_(IMP-1)、bla_(KPC-2)和bla_(VIM-2)),有3株菌同时携带bla_(KPC-2)和bla_(VIM-2)。使用毒力基因数据库VFDB对39株CRPA进行筛查,90%以上的菌株含有T3SS分泌蛋白基因exoY和exoT,85%的菌株含有外毒素蛋白基因exoA,本研究中携带外源碳青霉烯酶基因的分离株未筛查到携带exoA基因;使用PAst及pbMLST数据库对其进行筛查,共获得9种血清型及17种STs分型,不存在多重耐药血清型及大流行克隆群,但鉴定得到1株新ST型的临床CRPA分离株。系统发育树表明,分离株CRPJ 18091276与美国和巴西鉴定的菌株遗传距离较近,携带同种外源碳青霉烯酶基因的CRPA是在同一祖先的基础上进化而来。利用三代高通量测序技术对携带bla_(IMP-1)的CRPJ 18091276和CRPA 18083286以及同时携带bla_(KPC-2)和bla_(VIM-2)的CRPA 18102011进行全基因组测序并获得完整的染色体和质粒序列,通过生物信息学和比较基因组学对携带碳青霉烯酶基因的AGEs内部的精细结构进行注释并与同家族元件进行比较,判断遗传进化机制,采用接合转移试验鉴定分离菌株携带的外源碳青霉烯酶基因水平转移能力。结果表明,携带bla_(IMP-1)的CRPJ 18091276通过ICE1276捕获intI1-bla_(IMP-1)结构重组于res结合位点IΔTn4662a下游,捕获基因盒aacA4’形成In1886,通过Tn402转座模块中的res结合位点r1重组形成P.aeruginosa PA1 5W质粒中的结构(inntI1-bla_(IMP-1)-aacA4′-tniR-ISCfr1-aac(3)-IId-strB-strA-tniQ-tniB-tniA);CRPA 18083286通过Tn7转座子Tn6411捕获携带bla_(IMP-1)的In992具有碳青霉烯类药物抗性,该元件的Tn402样转座模块截断,导致In992无法移动,稳定存在于Tn6411中。bla_(VIM-2)以基因盒的形式被In2057捕获,重组于CRPA 18102011携带的IncpRBL16型巨质粒pP2011-1内部,通过同家族质粒结构对比,发现该家族质粒除已有的21个重组位点外,又形成3个新的重组位点(orf852、orf477及orf432),umuC是该家族质粒稳定的重组位点。该质粒通过新型整合子In2057捕获MBLs基因bla_(VIM-2),重组于orf477外源插入区,赋予细菌水解IP能力的同时有一定抵抗酶抑制剂的能力。bla_(KPC-2)由ΔISKpn6和ISKpn27所构成的复合转座子捕获,重组于CRPA 18102011携带的IncP6型泛宿主质粒pP2011-2内部。携带碳青霉烯酶基因的AGEs中,仅IncP6型和IncpRBL16型质粒可以通过接合转移的方式将bla_(KPC-2)和bla_(VIM-2)水平转移至大肠埃希氏菌(Escherichia coli DH5α中,接合转移效率均为 10-6。通过棋盘法最小抑菌浓度试验从484种药食同源中药单体化合物中优选出与碳青霉烯类药物亚胺培南(imipenem,IP)具有协同作用的2″-O-没食子酰基金丝桃苷(2″-O-galloylhyperin,HyG);通过细菌生长曲线及时间-杀菌曲线判断食源性协同剂与IP联Biomimetic bioreactor合作用下对耐药菌的抑制效果;采用头孢硝噻吩试验及转录组测序技术判断食源性协同剂的作用机制。结果表明,HyG在8μg/mL的浓度下将IP对CRPA 18102011及其接合子E.coli D201 1 的 MIC 值由 4,096 μg/mL 降至 1,024 μg/mL(FICI<0.5),与 IP 呈现协同作用。HyG在4 μg/mL的浓度下可将IP对携带bla_(KPC-2)的K.pneumonia 2445的MIC值由128μg/mL下降至64 μg/mL,该协同疗法对携带其它类型碳青霉烯酶的受试菌未见杀菌活性。细菌生长曲线和时间-杀菌曲线结果表明HyG在8 μg/mL浓度下对耐药菌的生长无影响并能够显著增强IP的杀菌活性,转录组测序显示该化合物对受试菌的染色体及质粒呈现多位点调控作用,通过基因本体(gene ontology,GO)富集分析发现,导致CRPA耐药性降低的主要原因是对其氧化还原过程中部分基因进行负反馈调节以增加细菌中活性氧自由基(radical oxygen species,ROS)的含量。该购买Lorlatinib化合物还对IncP6型质粒复制基因repA的表达显著抑制。通过观察头孢硝噻吩试验中颜色变化,该药物对repAIncP6下游的bla_(KPC-2)的表达具有抑制作用,但不如酶抑制剂阿维巴坦抑制效果显著。综合以上结果,在吉林省来源的40株CRP中鉴定到3种不同的外源碳青霉烯酶基因bla_(IMP-1)、bla_(VIM-2)以及bla_(KPC-2),这些基因的获得方式以整合子捕获为主,并存在一株菌同时携带多种碳青霉烯酶基因的情况。鉴定得到1株CRPA菌株携带IncpRBL16型巨质粒,该质粒的分子结构呈高度多样性及复杂的马赛克特征,大量AGEs的整合有助于耐药基因的累积和分布,提高CRP在药物选择压力下的生存能力,增加由它们引发感染的治疗难度。该质粒可以作为碳青霉烯酶基因的移动载体进一步在不同种细菌间进行水平转移。本研究通过体外试验首次确定了鹿蹄草(Pyrola)中的黄酮类化合物HyG具有作为IP协同剂的潜力,为后续CRPA的耐药机制和缓解耐药性相关研究提供理论依据,为CRPA的感染提供一种新型食源性天然化合物的辅助治疗策略。

目的：观察吉非替尼联合放化疗对EGFR突变型非小细胞肺癌患者的效果。方法：回顾性分析2019年1月至2020年1月该院收治的74例EGFR突变型NSCLC患者的临床资料，按照治疗方法不同将其分为对照组与观察组各37例。对照组采用多西他赛、顺铂化疗联合放疗，观察组在对照组基础上联合吉非替尼selleck合成片治疗。比较两组临床疗效、不良反应发生率、肿瘤标志物[胸苷激酶1(TK1)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、组织抑制金属蛋白酶-1(TIMP-1)]水平、生存率。结果：观察组疾病控制率为81.08%，高于对照组的59.46%，差异有统计学意义（P<Hepatocyte nuclear factor0.05）；两组不良反应发生率比较，差异无统计学意义（P<0.05）；治疗后，两组TK1、MMP-9、TIMP-1水平均低于治疗前，且观察组低于对照组，EPZ-6438生产商差异有统计学意义（P<0.05）；两组6个月生存率比较，差异无统计学意义（P>0.05）；观察组1年、1.5年、2年生存率均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：吉非替尼联合放疗与多西他赛、顺铂化疗用于EGFR突变型NSCLC患者可提高DCR和远期生存率，降低肿瘤标志物水平，其效果优于多西他赛、顺铂化疗联合放疗。

研究HHV-6A感染神经胶质瘤细胞中RUNX3与miR-301a表达的相关性及意义。神经胶质瘤细胞株U251、U87、U373感染HHV-6A，检测RUNX3、miR-301a的相对表达水平；U87细胞进行分组，感染HHV-6A，转染阴性对照（NC）miR模拟物、miR-301a模拟物、NC miR抑制物或miR-301a抑制物，检测细胞增殖A450水平、迁移数目、侵袭数目、miR-301a、RUNX3、c-myc、E-cadherin、MMP2、MMP9的相对表达水平、RUNX3野生型和突变型报告基因的荧光活力。研究结果显示HHV-6A感染后U251、U87及U373细胞中RUNErastin体外X3的mRNA相对表达水平均降低、miR-301a相对表达水平均增加，其中U87细胞中RUNX3、miR-301a表达变化最显著。miR-301a组U87细胞中RUNX3野生型报告基因的荧光活力均低于miR-NC组（P<0.05）,RUNX3突变型报告基因的荧光活力与miR-NC组比较无差异（P>0.05）;HHV-6A感染的同时转染miR抑制物，miR-NC抑制物+HHV-6A组U87细胞的A450水平、迁移数目、侵袭数目、miR-301a、c-myc、MMP2、MMP9的相对表达水平均高于miR-NC抑制物组，RUNX3、Ecadherin的相对表达水平均低于miR-NC抑制物组（P<0.05）;miR-301a抑制物+HHV-6A组U87细胞的A450水平、迁移数目、侵袭数目、miR-301a、c-myc、MMP2、MMP9的MLN8237配制相对表达水平均低于miR-NC抑制物+HHV-6A组，RUNX3、E-cadherin的相对表达水平均高于morganismal biologyiR-NC抑制物+HHV-6A组（P<0.05）。综上，HHV-6A感染促进神经胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭，这一促进作用与增加miR-301a表达、抑制RUNX3表达有关。

目的 探讨地榆槐花汤对人结直肠癌HCT116细胞增殖和凋亡的影响及机制。方法 将HCT116细胞分为空白对照组（空白血清）、阳性对照组（奥沙利铂含药血清）、地榆槐花汤低、中、高剂量组（10%、15%、20%地榆槐花汤含药血清），给予相应含药血清干预，MTT检测细胞增殖活FUT-175性；平板克隆形成实验检测各组细胞克隆形成能力；AnnexinV-FITC/PI法检测细胞的凋亡水平；Hoechst33258染色观察细胞形态变化；Westernblot检测细胞中Bax、BcParamedian approachl-2、cleavedcaspase-3、p38MAPK、p-p38MAPK(Thr180/Tyr182)、MDM2和p53等蛋白表达水平。进一步将HCT116细胞分为空白对照组（空白血清）、地榆槐花汤组（20%地榆槐花汤含药血清）、p38MAPK抑制剂TAK-715组（10mmol/LTAK-715）和联合组（20%地榆槐花Histone Demethylase抑制剂汤含药血清+10mmol/LTAK-715），采用20%地榆槐花汤含药血清和10mmol/LTAK-715进行干预，MTT检测各组细胞增殖活性；AnnexinV-FITC/PI法检测细胞凋亡水平；Westernblot检测细胞中p38MAPK、p-p38MAPK、MDM2、p53等蛋白表达水平。结果 与空白对照组相比，地榆槐花汤中、高剂量组及阳性对照组HCT116细胞的增殖活性和克隆形成能力显著降低（P＜0.01），细胞核呈皱缩、碎块状变化，细胞凋亡水平显著增加（P＜0.01），Bax/Bcl-2、cleavedcaspase-3、p-p38MAPK/p38MAPK和p53等蛋白表达水平显著上调（P＜0.05），MDM2蛋白表达水平显著下调（P＜0.01）。然而，联合TAK-715处理可明显降低地榆槐花汤对HCT116细胞增殖的抑制作用和凋亡的诱导作用（P＜0.05）。结论 地榆槐花汤可能通过调控p38 MAPK/p53通路抑制HCT116细胞的增殖，并诱导细胞凋亡。