研究目的:创伤后骨性关节炎(Post-traumatic osteoarthritis,PTOA)是骨性关节炎(Osteoarthritis,OA)的一种亚型,指由创伤引起的关节软骨变性、Tezacaftor破坏,以及在此基础上出现的关节退变及继发性骨质增生。临床上表现为受累关节疼痛、关节障碍,严重者可引起关节畸形,甚至致残。创伤后骨性关节炎的主要损害部位是关节软骨,其中以髋、膝、踝关节等大关节最为多见,关节软骨的变性、软化、弹性丧失、龟裂和缺损均会导致严重的临床症状,显著降低患者生活质量,特别是运动员赛场表现明显下降,甚至导致运动员职业生涯提前结束。创伤后骨性关节炎造成的关节软骨退变和破坏常常难以自愈,这主要是由于关节软骨细胞本身属于稳定细胞,其分化及迁徙能力较差,不能原位再生或迅速聚集到损伤部位,导致软骨自我修复能力差。目前研究认为软骨损伤后由于反复的炎症刺激,导致关节内过量产生的氧自由基(Reactive Oxygen Species,ROS),刺激关节周围软组织,进一步加重了炎症。所以从理论上来说,通过对于关节内过量产生的ROS的清除治疗,理论上可以达到缓解创伤后骨性关节炎的目的。依达拉奉(Edaravone)作为临床上应用时间最长也是最有效的自由基清除剂在缺血-再灌注损伤的治疗应用多年,特别是对于脑卒中的治疗,有着十分显著的效果,但其是否对创伤后骨性关节炎有治疗作用尚无研究,故本研究目的在于依达拉奉是否对于创伤后骨性关节炎的动物模型有软骨保护作用以及初步探索依达拉奉对于大鼠创伤后骨性关节炎的治疗剂量及治疗时间。研究方法:随机选取3月龄50只雄性SD大鼠通过切除大鼠膝关节前交叉韧带、内侧副韧带和内侧半月板建立创伤后骨性关节炎动物模型。8周后,在50只手术后大鼠中随机选取5只通过空气注射法处死,观察其膝关节软骨损伤情况,通过膝关节软损伤评分确认其造模是否成功。将45只造模成功的大叔分为5组,分别为高剂量组(9mg/kg,H)、中剂量组(6mg/kg,M)、低剂量组(3mg/kg,L)、美洛昔康组(S)、模型组(Mo),选取相同月龄的正常SD大鼠9只作为空白对照组(NS),所有剂量均为体表面积换算得出,每天两次给予大鼠腹腔注射(空白对照组注射等剂量的生理盐水)。分别干预2周、4周、6周后,分别随机从各组选取3只,空气注射法处死,获取膝关节液及膝关节标本。用酶联免疫吸附剂测定(Sandwich Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测膝关节液中的白介素-1、肿瘤坏死因子-α的量,测量每个关节面的损伤面积,切片后进行苏木素-伊红(HE)染色观察软骨形态变化和免疫组化染色检测软骨组织中白介素-1和肿瘤坏死因子-α的量。研究结果:经过确认所有手术后大鼠均造模成功,并开始予以按计划进行干预。经2周干预后,相较于模型组,高剂量、中剂量、低剂量组的白介素-1、肿瘤坏死因子-α两项炎症指标均小于模型组(P<0.05),但是均高于美洛昔康组和空白对照组(P<0.05),同时三个干预组各指标无统计学差异(P>0.05);4周干预后,三个干预组炎症指数相同均小于模型组(P<0.05),其中中剂量组是三个干预组中炎症指数最低,且与美洛昔康组和空白对照组无统计学差异,与模型组相比,模型组炎症指标更高;6周干预后,三个干预组炎症指数相同均小于模型组(P<0.05),其中中剂量组是三个干预组中炎症指数最低,但无统计学差异,同时与美洛昔康组和空白对照组无统计学差异,与模型组相比,模型组炎症指标更高。干预6周与干预2、4周相比,模型组的关节损伤面积显著增大(P<0.05),苏木素-伊红染色显示关节炎评分显著增高(P<0.05);同时,三个时间点的高剂量、中剂量、低剂量、美洛昔康组的关节损伤面积相比较,差异无统计学意义(P>0.05),但是均小于模型组(P<0.05)。免疫medically ill组织化学染色显示:2周干预后,相较于模型组,高剂量、中剂量、低剂量组的白介素-1、肿瘤坏死因子-α两项炎症指标均小于模型组(P<0.05),但是均高于美洛昔康组和空白对照组(P<0.05),同时三个干预组各指标无统计学差异(P>0.05);4周干预后,三个干预组炎症指数相同均小于模型组(P<0.05),其中中剂量组是三个干预组中炎症指数最低,且与美洛昔康组和空白对照组无统计学差异,与模型组相比,模型组炎症指标更高;6周干预后,三个干预组炎症指数相同均小于模型组(P<0.05),其中中剂量组是三个干预组中炎症指数最低,但无统计学差异,同时与美洛昔康组和空白对照组无统计学差异,与模型组相比,模型组炎症指标更高。研究结论:1.依达拉奉可以通过清除氧自由基缓解创伤后骨性关节炎的症状,改善模型大鼠的关节症状;2.依达拉奉不能逆转或者促进修复已被破坏的关节软骨;3.依达拉奉双倍标Roxadustat化学结构准剂量治疗四周效果可能是最佳剂量和疗程。
2，4-二氯苯酚羟化酶TfdB-JLU及其工程菌催化吲哚转化靛蓝的研究
2,4-二氯苯酚羟化酶TfdB-JLU作为一种新颖的羟化酶,具有较广的芳香族化合物底物谱,对多种氯酚类和联苯类底物均有一定的催化活性。课题组前期通过对TfdB-JLU底物非专一性(substrate promiscuity)与蛋白结构之间关系的研究,利用半理性设计对其催化氯酚类和联苯类底物的非专一性实现了调控。近期研究发现,TfdB-JLU还可以催化多种吲哚类杂环芳香化合物,但目前尚不清楚其催化机制,具有实际应用价值的吲哚生物催化转化体系也鲜有报道。本研究一PF-07321332核磁方面通过对TfdB-JLU的结构及其与吲哚之间的相互作用分析,选择可能与底物具有相互作用或影响底物进入活性中心的氨基酸作为突变位点,通过对野生型及其突变体进行表达、纯化、酶活检测,结合分子动力学模拟研究,对TfdB-JLU催化吲哚的机制进行了初步探究;另一方面考虑到酶促吲哚生物转化过程中酶纯化过程繁琐、耗损率高和需要额外添加昂贵的辅酶等因素,本研究探讨了以TfdB-JLU工程菌全细胞催化吲哚转化靛蓝的生物转化路径,并对转化条件进行了优化,为探索TfdB-JLU催化吲哚生物转化的实际应用提供了可能性。本研究的主要内容和研究结果如下:(1)2,4-二氯苯酚羟化酶TfdB-JLU催化吲哚的研究以2-羟基联苯-3-单加氧酶(PDB ID:5BRT)的晶体结构为模板进行同源模建得到TfdB-JLU的结构,利用Auto Dock 4.2与吲哚进行分子对接;基于分子对接结果选择了His47、Met251、Pro316这三个可能与底物具有相互作用或影响底物进入活性口袋的位点进行单点和组合突变,对TfdB-JLU的野生型和突变体进行表达、纯化和酶活检测,发现与野生型相比,突变体M251G和P316G提高了对吲哚的催化活性,而突变体H47A、M251G/P316G则基本丧失了对吲哚的催化活性。通过分子对接结果推测,突变体P316G催化吲哚活性提高的原因可能是酶与吲哚之间的价键作用增加,提高了与吲哚的亲和力;突变体M251G催化吲哚活性提高的原因可能是突变后酶活性口袋的入口变大,更有利于底物的进入;突变体H47A催化吲哚活性基本丧失,说明47位的组氨酸可能是TfdB-JLU催化吲哚的关键氨基酸之一。通过对野生型和突变体的分子动力学模拟研究推测组合突变体M251G/P316G催化吲哚活性大幅降低的原因可能是突变对活性口袋附近的结构柔性改变太大导致酶的稳定性降低。(2)TfdB-JLU工程菌全细胞催化吲哚转化靛蓝的研究本研究建立了TfdB-JLU工程菌全细胞催化吲哚转化靛蓝的生物转化体系,并对转化条件进行了优化,以提高吲哚转化靛蓝的效率。结果表明TfdB-JLU工程菌的全细胞催化能够将吲哚转化为靛蓝,靛蓝的起始产率为11Pidnarulex价格.9%;对转化条件进Paramedian approach行优化后的最适条件为:培养基为M9培养基,诱导时间为8 h,吲哚浓度为2.5 m M,反应温度为25℃,反应时间为16 h,反应p H为9,在此条件下TfdBJLU工程菌催化吲哚转化靛蓝的产率达到35.7%。综上所述,本研究运用蛋白质工程和生物信息学手段对TfdB-JLU催化吲哚进行了初步研究,发现酶局部结构变化会对TfdB-JLU与吲哚的结合方式、结合能力和酶的稳定性产生影响,进而影响其催化吲哚的能力,同时发现47位的组氨酸可能是影响TfdB-JLU催化吲哚的关键氨基酸之一,为TfdB-JLU催化吲哚机制的解析奠定了一定基础;本研究也建立了TfdB-JLU工程菌全细胞催化吲哚转化靛蓝的生物转化体系,将对吲哚类废水的处理和资源化转化具有重要意义。
桥本病的证型诊断模型研究及夏朴消瘿方干预焦亡相关机制初探
研究背景桥本甲状腺炎(Hashimoto’s Thyroiditis,HT,又称桥本病)又称慢性淋巴细胞性甲状腺炎(chronic lymphocytic thyroiditis,CLT),是自身免疫性甲状腺炎(autoimmune thyroiditis,AIT)的常见类型。近年来随着人们碘摄入的增多、生活节奏加快等环境因素改变,HT的发病率逐渐升高。大多数HT患者早期缺乏临床表现,有发展为永久性甲减、甲状腺结节甚至甲状腺癌的风险,严重影响患者的生活质量及远期预后。HT发病机理复杂,目前临床尚缺乏特异性的治疗,主要根据患者甲功情况采取甲状腺激素替代治疗,大多数甲功正常、仅相关抗体升高的人群仍停留于被动观察阶段。中医药在治疗HT方面积累了一定经验,在辨证论治、缓解症状、调节免疫、改善甲功等方面疗效确切,值得进一步研究。但目前HT的中医辨证缺乏统一性,领域内没有合适的算法来探索HT证型与临床特征之间的关联规则;此外临证治疗HT的有效中药处方的作用机制尚不明确。因此,本研究依托国家自然科学基金(项目批号:82074412)探索HT证型诊断模型,通过动物实验研究中药治疗HT的疗效及作用机制,为HT的中医诊断及中药治疗提供借鉴和科学依据。研究目的1.利用XGBoost算法构建HT证型诊断模型,并探索证型分类的特征变量。2.通过网络药理学,探讨有效中药处方夏朴消瘿方的有效成分,治疗HT的潜在靶点及潜在作用机制。3.通过动物实验,观察夏朴消瘿方治疗HT的效果及作用机制。研究方法1.纳入病例组HT患者141例,对照组非HT人群236例,采集受试者的甲功指标、甲状腺彩超指标、症状、舌脉等信息,利用XGBoost算法构建HT的中医证型诊断模型,以预测精确度、变量重要性排序、混淆矩阵等评价模型性能。2.利用TCMSP获取夏朴消瘿方有效成分,通过Uniprot蛋白质数据库进行信息标准化处理,通过GeneCards、OMIM,DrugBank及PharmGkb数据库搜集HT疾病相关基因;利用STRING构建蛋白互作网络,筛选夏朴消瘿方治疗HT的潜在靶点;采用Cytoscape 3.7.2构建化合物-靶点网络。通过DAVID进行GO功能及KEGG通路富集分析,获取潜在通路。3.将6-8周龄的雌性SPF级SD大鼠54只随机分为正常组(9)、模型组(45),模型组采用猪甲状腺球蛋白混合弗氏佐剂免疫注射联合高碘喂养,成模后分为模型组、中药高剂量组(中药液17.24g/Kg/d)、中药中剂量组(中药液8.62g/Kg/d)、中药低剂量组(中药液4.31g/Kg/d)、雷公藤多苷组(雷公藤多苷片溶液6.35mg/Kg/d)灌胃,给药体积均为0.908mL/100g,正常组、模型组给予同等体积蒸馏水。干预8周后处死动物并留取样本,通过血清甲状腺功能检测、光镜、透射电镜等方法观察夏朴消瘿汤对大鼠甲状腺形态结构及功能的影响,采用RT-PCR、Western Blot、化学荧光法和ELISA等技术,探讨夏朴消瘿方是否通过调控大鼠体内miR-423-5p介导的NOX4/ROS/NF-κ B通路影响甲状腺滤泡细胞焦亡,从而发挥治疗作用。研究结果1.①分析本研究纳入的病例组及对照组的临床特征,认为性别、TPOAb、TGAb、TSH、FT4、TRAb水平、甲状腺左叶宽度、甲状腺左叶厚度、甲状腺右叶厚度、甲状腺峡部厚度及颈部淋巴结大小在两组间存在差异(P<0.05);病例组主观症状出现频次最高的为乏力、口干、失眠多梦、畏寒肢冷和便溏,舌脉信息出现频次最高的单一诊察内容分别为舌淡红、舌体正常、舌苔薄、舌下脉络正常、脉弦;比较病例组内肝郁脾虚证、气郁痰阻证、心肝火旺证、痰瘀互结证、气阴两虚证及脾肾阳虚证患者的临床特征,认为TSH水平在不同证型间存在差异(P<0.05),但甲功状态(甲功正常、临床甲减、亚临床甲减、甲亢、亚临床甲亢)与证型之间不存在关联(P>0.05)。②XGBoost算法对输出证型分类的变量重要性排序结果为TPOAb、少气懒言、TGAb、下肢浮肿、面色晄白、口渴喜饮、腹胀、便溏、腰膝酸软、咽部异物感、头晕、痰多、便秘、甲状腺左叶宽度、形体消瘦medical liability、病情随情绪增减、畏寒肢冷、乏力、TSH水平、TT3水平、口苦、性别、FT4水平、甲状腺漫肿,无结块,按之柔软、舌体。XGBoost算法建立的HT证型诊断模型的准确率=0.99,对非HT诊断的精确率=1.00,召回率=1.00,F1值=1.00;对HT肝郁脾虚证诊断的精确率=1.00,召回率=1.00,F1值=1.00;对HT气郁痰阻证诊断的精确率=1.00,召回率=0.83,F1值=0.91;对HT心肝火旺证诊断的精确率=0.97,召回率=1.00,F1值=0.98;对HT痰瘀互结证诊断的精确率=1.00,召回率=1.00,F1值=1.00;对HT气阴两虚证诊断的精确率=0.98,召回率=1.00,F1值=0.99;对HT脾肾阳虚证诊断的精确率=1.00,召回率=1.00,F1值=1.00。总体模型准确率高,性能好,研究所纳入的临床特征与最终的证型诊断之间存在较强的因果逻辑。2.①夏朴消瘿方治疗HT的核心有效成分包括β-谷甾醇、黄芩苷、黄芩素、槲皮苷、异鼠李素等,可以发挥抗氧化、抗炎免疫等作用。②夏朴消瘿方治疗HT 可能通过调节 PTGS2、ESR1、ESR2、CASP8、STAT3、BCL2、IL1B 等靶标,参与免疫调节、细胞焦亡、炎症反应等。③夏朴消瘿方目前主要作用于Th17细胞分化通路、IL-17信号通路、Toll样受体信号通路等,影响活性氧代谢过程、脂多糖反应等生物过程,涉及膜筏、膜微区等细胞成分,影响细胞因子受体结合、血红素结合等分子功能。3.①猪甲状腺球蛋白混合免疫佐剂结合高碘喂养的实验性自身免疫甲状腺炎大鼠(experimental autoimmune thyroiditis rats,EAT)造模成功,模型组大鼠血清TPO-Ab、TG-Ab、TSH、FT3及FT4水平较正常组升高(P<0.01);与模型组相比,高剂量组、中剂量组、雷公藤多苷组血清TPO-Ab、TG-Ab、TSH、FT3及FT4水平均降低(P<0.05);低剂量组血清FT3水平降低(P<0.05),TPO-Ab、TG-Ab、TSH及FT4水平均降低,但与模型组的差异无统计学意义。病理形态方面,HE染色显示模型组大鼠甲状腺滤泡破坏,腺体较多的淋巴细胞浸润,间质可见纤维增生及坏死的细胞;电镜结果显示模型组大鼠甲状腺滤泡细胞及细胞器结构破坏,呈焦亡的形态特征,在中药及雷公藤多苷干预后,大鼠甲状腺损伤及甲状腺滤泡细胞焦亡均得到不同程度的改善。②模型组大鼠甲状腺GSDMD的mRNA表达较正常大鼠上调(P<0.05),高剂量组大鼠甲状腺GSDMD的mRNA表达较模型组下调(P<0.01),中剂量组、低剂量组及雷公藤多苷组大鼠甲状腺GSDMD的mRNA表达较模型组均下调,但未见统计学差异;模型组大鼠甲状腺GSDMD的蛋白表达较正常大鼠上调(P<0.01),各干预组大鼠甲状腺GSDMD的蛋白表达较模型组均下调(P<0.05)。模型组大鼠甲状腺NLRP3的mRNA表达较正常大鼠上调(P<0.01),高剂量组大鼠甲状腺NLRP3的mRNA表达较模型组下调(P<0.05),中剂量组、低剂量组及雷公藤多苷组大鼠甲状腺NLRP3的mRNA表达较模型组均下调,但差异无统计学意义;模型组大鼠甲状腺NLRP3的蛋白表达较正常大鼠上调(P<0.01),高剂量组、中剂量组、雷公藤多苷组大鼠甲状腺NLRP3的蛋白表达较模型组均下调(P<0.01),低剂量组大鼠大鼠甲状腺NLRP3的蛋白表达较模型组下调,但差异无统计学意义。模型组大鼠甲状腺Caspase-1的mRNA表达较正常大鼠上调(P<0.01),高剂量、中剂量、雷公藤多苷组大鼠甲状腺Caspase-1的mRNA表达较模型组均下调(P<0.01),低剂量组大鼠甲状腺Caspase-1的mRNA表达较模型组下调,但未见统计学差异;模型组大鼠甲状腺Caspase-1的蛋白表达较正常大鼠上调(P<0.01),各干预组大鼠甲状腺Caspase-1的蛋白表达较模型组均下调(P<0.01)。模型组大鼠甲状腺ASC的mRNA表达较正常大鼠上调,但差异无统计学意义,高剂量组大鼠甲状腺ASC的mRNA表达较模型组下调(P<0.05),中剂量组、低剂量组及雷公藤多苷组鼠甲状腺ASC的mRNA表达较模型组下调,但差异未见统计学意义;模型组大鼠甲状腺ASC的蛋白表达较正常大鼠上调(P<0.01),各干预组大鼠甲状腺ASC的蛋白表达较模型组均下调(P<0.01)。模型组大鼠甲状腺IL-18的mRNA表达较正常大鼠上调(P<0.01),各干预组大鼠甲状腺IL-18的mRNA表达较模型组均下调(P<0.01);模型组大鼠甲状腺IL-18的蛋白表达较正常大鼠上调(P<0.01),各干预组大鼠甲状腺IL-18的蛋白较模型组均下调(P<0.01);模型组大鼠血清IL-18水平与正常组相比无统计学差异,与模型组相比,各干预组的IL-18水平变化均未见统计学差异。模型组大鼠甲状腺IL-1β的mRNA表达较正常大鼠上调,但差异未见统计学意义,各干预组大鼠甲状腺IL-1 β的mRNA表达较模型组均下调,但差异未见统计学意义;模型组大鼠甲状腺IL-1 β的蛋白表达较正常大鼠上调(P<0.05),各干预组大鼠甲状腺IL-1β的蛋白表达较模型组均下调,但差异未见统计学意义;模型组大鼠血清IL-1β含量较正常组增加(P<0.01),高剂量组、中剂量组及雷公藤多苷组大鼠血清IL-1β水平较模型组均下降(P<0.05),低剂量组血清IL-1 β水平较模型组均下降,但差异无统计学意义。③模型组大鼠甲状腺组织的miR-423-5p的表达水平较正常组下调(P<0.05),与模型组相比,各干预组甲状腺组织的miR-423-5p的表达均上调,但差异无统计学意义;模型组大鼠甲状腺NOX4的mRNA表达较正常大鼠上调(P<0.01),各干预组大鼠甲状腺NOX4的mRNA表达较模型组均下调(P<0.01);模型组大鼠甲状腺NOX4的蛋白表达较正常大鼠上调(P<0.01),高剂量组、中剂量组和雷公藤多苷组大鼠甲状腺NOX4的蛋白表达较模型组均下调(P<0.01)),低剂量组大鼠甲状腺NOX4的蛋白表达较模型组下调,但差异无统计学意义。模型大鼠甲状腺ROS含量较正常大鼠增加(P<0.01);与模型组相比,各干预组大鼠甲状腺ROS含量降低(P<0.01),低剂量组大鼠甲状腺ROS含量下降,但与模型组相比未见统计学差异。模型组大鼠甲状腺NF-κ B的mRNA表达较正常大鼠上调(P<0.01),高剂量组大鼠甲状腺NF-κB的mRNA表达较模型组下调(P<0.05),中剂量组、低剂量组及雷公藤多苷组大鼠甲状腺NF-κ B的mRNA表达与模型组相比均下调,但差异未见统计学意义;模型组大鼠甲状腺NF-κB的蛋白表达较正常大鼠上调(P<0.01),各干预组大鼠甲状腺NF-κ B的蛋白表达较模型组均下调(P<0.01)。研究结论1.患者的主、客观临床特征在HT不同证型间存在共性和差异,XGBoost算法能够获取中医证候分类的特征变量及客观规则,建立具有准确性和可点击此处解释性的HT证型诊断模型。本研究的模型对HT辨证分类的特征重要性排序前五位为:TPOAb、少气懒言、TGAb、下肢浮肿、面色晄白,临证中可重点关注以上特征,予以相应的诊疗措施。2.夏朴消瘿方能多成分、多靶点、多途径协同治疗HT,其干预机制主要涉及活性氧代谢、炎症反应、免疫调节及细胞焦亡等。3.夏朴消瘿方能有效改善EAT大鼠的甲功及甲状腺自身抗体水平,减轻甲状腺病理损伤,保护甲状腺滤泡细胞。夏朴消瘿方通过上调EAT大鼠甲状腺miR-423-5p的表达,负向调节NOX4/ROS/NF-K B信号通路,从而调控NLRP3炎症小体诱导的细胞焦亡及后续的炎症应答,降NSC 119875低EAT大鼠体内焦亡相关靶点 NLRP3、Caspase-1、ASC、GSDMD 及炎症因子 IL-18、IL-1 β的表达,发挥治疗HT的作用。
人工虎骨粉对SAMP8小鼠肌少症的预防作用
目的 研究人工虎骨粉对快速老化小鼠(senescence accelerated mouse prone 8,SAMP8)肌少症的预防作用并探讨其相关机制。方法 将42只12周龄雄性SAMP8小鼠分为两组：肌少组(SAR组，常规饮食)和虎骨粉组(JTG组，饮食中添加0.2%人工虎骨粉),21只12周龄抗快速老化小鼠(senescence accelerated mouse resistance 1,SAMR1)Leber’s Hereditary Optic Neuropathy作为对照组(NC组，常规饮食)。喂养期间，监测小鼠体质量和四肢握力，喂养28周后，小鼠肌少症模型成功建立。随后，处死小鼠，分离腓肠肌(gastrocnemius, GAS)和胫前肌(tibialis anterior, TA)并称重，测量肌纤维横截面积(cross-sectional area, CSA),进行WesternAlisertib细胞培养 blot和PCR实验。同时，进行人工虎骨粉对C2C12细胞成肌分化能力影响的实验。结果 与肌少组相比，虎骨粉组体质量、握力、CSA均有明显增加，且Gpx4和Nrf2基因表达上调(P<0.05)。体外实验中，添加人工虎骨粉水提物和柠檬酸铁的C2C12细胞比只添加柠檬酸铁的C2C12细胞活性高且分化后的肌纤维直径更粗(P<0.05)。结论人工虎骨粉可预防SAMP8小鼠肌少症，其PF-6463922化学结构机制可能与抑制铁死亡相关。
通过定点突变提高纳豆激酶纤溶活性和热稳定性
纳豆激酶(Nattokinase, NK)是一种纤溶酶，可溶解血栓，常用于治疗心血管疾病(CVDs)。然而，野生型NK往往表现出很少的纤溶能力和较低的热稳定性，针对如何提高NK的热稳定性和活性开展研究。使用重叠延伸PCR法将NK中位于194位的Ser替换为Pro,为验证突变后的热稳定性，将野生型NK和突变体S194P均在不同温度下孵育相同时间Cobimetinib生产商，使用纤维蛋白板法测定二者酶活，验证热稳定性。成功构建了pET-26b-NK_(s194p),测量酶活结果显示，野生型NK和突变体S194P酶活分别达到1selleck NMR01.30 IU/mL和123.23 IU/mL,结果表明突变体S194P的酶活比野生型NK高(18.10±2)%,将野生型NK和突变体S194P在60～65℃温度下孵育30 min后测量酶活，野生型NK在63℃时丧失酶活，突变体S194P在65Oral probiotic℃时丧失酶活，耐热温度提高2℃。结果表明，突变体S194p的蛋白结构在突变后发生了改变，使NK提高了耐热温度。
红细胞分布宽度-血小板比值评估自身免疫性肝炎患者肝纤维化严重程度的回顾性研究
目的 比较自身免疫性肝炎(AIH)、药物性肝损伤(DILI)的临床资料差异，并评估AIH患者肝纤维化严重程度的影响因素及其诊断效能。方法 回顾2015年6月—2022年8月期间苏州市中西医结合医院收治的AIH患者45例(AIH组),男4例、女41例；DILI患者86例(DILI组),男23例、女63例；AIH、DILI诊断符合要求。使用Metavir系统对肝纤维化程度进行评分，其中
地衣芽孢杆菌固态发酵蛹虫草粉制备酸性多糖及其降血糖活性研究
近年来,已经有多篇报道证明中草药发酵可以提高其中提取物的产率和活性,蛹虫草是冬虫夏草的替代品。蛹虫草中含有核苷类物质、甾醇和糖醇类、多糖、多肽和无机元素、凝集素、纤维蛋白溶解酶类和超氧化物歧化酶等生物活性成分,其中蛹虫草多糖可以起到降血糖、降血脂以及抗肿瘤的作用。地衣芽孢杆菌是治疗肠胃炎的药物整肠生的主要成分,具有调整菌群失调的作用。为了提高多糖的降血糖活性以及多糖的产率,利用地衣芽孢杆菌发酵蛹虫草粉,优化最佳发酵条件,提取发酵蛹虫草胞外多糖,解析构效关系,建立糖尿病小鼠模型探究多糖的降血糖活性并通过体外试验探究多糖可能的降糖机制。本研究得出以下结果:1.通过观察地衣芽孢杆菌在蛹虫草基质上发酵情况,确定二者是合适的发酵组合,成功建立了地衣芽孢杆菌和蛹虫草固态发酵体系。通过对比发酵前后多糖的提取率和DPPH清除率活性,发现发酵可以提高多糖的产率和抗氧化活性。通过单因素和响应面试验,测得多糖最佳提取条件为发酵温度33℃、发酵时间2.22d、料液比1:3.25、接种量3.91%,此时多糖提取率达到21.24%。2.蛹虫草多糖测得分子量为5.948×10~3Da,主要是由葡萄糖,甘露糖,半乳糖和阿拉伯糖组成,DPPH清除率活chondrogenic differentiation media性为60.85±4.09%。发酵蛹虫草多糖分子量为4.25×10~3Da;主要组成为岩藻糖、半乳糖、甘露糖和葡萄糖,DPPH清除率活性为72.53±3.73%。对比二者的红外光谱图,表明发酵没有改变多糖的主框架结构。对比二者的扫描电镜图,发现发酵可能破坏了多糖分子间的部分氢键,使多糖的溶解度升高。3.采用动物实验,用蛹虫草多糖和发酵蛹虫草多糖分别处理28 d后,治疗组的糖尿病小鼠空腹血糖水平有显著的降低,胰岛素水平和抗氧化酶活性都逐步增高,其中发酵蛹虫草多糖组的抗氧化酶活性和胰岛素水平均显著高于二甲双胍组,同时也显著高于蛹虫草多糖组。脏更多器比说明了两种多糖均能改善脏器肿大,且发酵蛹虫草多糖效果更佳。急性毒性试验表明,两种多糖在1500 mg/kg的剂量下灌胃正常小鼠是安全的。通过小鼠体外实验,发现两种多糖对小肠酶活性均有抑制作用;抑制作用类型均为反竞争性抑制作用,且发酵蛹虫草多糖对小肠酶的抑制作用更佳。结果表明发酵提高了多糖的降血糖活性,且可能的降糖机制之一是通过抑制小肠酶活性来延缓餐后血糖升selleckchem高。综上所述,将蛹虫草和地衣芽孢杆菌进行固态发酵,不但提高了多糖的产率,还提高了多糖的抗氧化活性以及降血糖活性。发酵蛹虫草多糖可能作为一种预防糖尿病有效且安全的功能性食品。
基于代谢组学的柠檬烯抗非小细胞肺癌作用机制研究
目的 采用非靶向代谢组学等方法，探究柠檬烯抑制非小细胞肺癌增殖的作用机制。方法 以肺癌A549细胞为研究对象，通过CCK-8法测定柠檬烯抑制A549细胞活力及CL 318952采购IC_(50)；通过集落形成、流式细胞检测、铁含量测定及线粒体染色等实验，分别评价柠檬烯的体外抗肺癌及诱导铁死亡作用；代谢组学分析发现柠檬烯的潜在作用通路；最后采用Western blotting对相关通路主要蛋白进行验证。结果 与对照组相比，柠檬烯给药组可以显著抑制A549细胞的增殖及集JQ1抑制剂落的形成，且呈剂量依赖性；光学显微镜观察发现，柠檬烯给药后A549细胞出现脱落现象，并可显著改变其形态；同时柠檬烯具有诱导A549细胞凋亡作用，并阻滞在G_0-G_1期；共聚焦显微镜发现柠檬烯作用后，A549细胞线粒体荧光减弱，同时细胞内铁含量亦显著增加，呈现典型的铁死亡表现；代谢组学研究发现谷胱甘肽(glutathione,GSH)代谢、精氨酸生物合成、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢及半胱氨酸和蛋氨酸代谢等多条差异代谢通路，这些通路与细胞内GSH合成密切相关；Western blotting实验发现，柠檬烯给药后细胞中SLC40A1、SLC7A11(xCT)及GPX4蛋白含量显著减少。结论 柠檬烯抗肺癌作用机制可能与降低肺癌细胞中GSH合成及增加Fe_(2+)含量诱Disease biomarker导其铁死亡有关。
基于网络药理学和分子对接技术的参知健脑方对糖尿病认知功能障碍的作用机制研究
运用网络药理学方法及分子对接技术初步探讨参知健脑方治疗糖尿病认知功能障碍的潜在作用机制。采用TCMSP、TCMMESH和ETCM平台筛选出参知健脑方中人参、知母、赤芍的活性成分和作用靶点，利用GeneCards、OMIM、DisGeNET和DigSee等数据库检索糖尿病认知medicinal chemistry功能障碍的相关靶点，然后运用Cytoscape 3.8.0构建“中药活性成分靶点”网络，并通过STRING平台得到药物与疾病靶点的蛋白质相互作用（PPI）网络，DAVID进行基因本体（GO）功能富集分析和基于京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。最后，对参知健脑方关键活性成分与关键靶点进行分子对接。共筛选出参知健脑IACS-010759体外方的43个活性成分和相应靶点BMS-354825759个，糖尿病认知功能障碍靶点6 314个；获得“药物疾病”共同靶点584个，关键靶点为AKT1、TNF、CTNNB1、SRC和EGFR。分子对接结果显示，参知健脑方关键活性成分与关键靶点的结合潜能和活性较好。本研究初步探讨了参知健脑方对糖尿病认知功能障碍的多维网络调控机制，为临床研究提供了可靠的理论依据。
毛囊单位提取移植术联合富血小板血浆治疗继发性瘢痕秃发的临床效果
目的 探讨毛囊单位提取移植术(FUE)联合富血小板血浆(PRP)治疗继发性瘢痕秃发的临床效果。方法 采用回顾性研究,将在选取2017年6月-2019年6月在滨州医学院附属医院美容医学部就诊的仅行毛囊单位移植术的继发性瘢痕秃发患者30例纳入FUE组,将2019年8月-2021年8月在滨州医学院附属医院美容医学部就诊行毛囊移植术+富血小板血浆(术前2h及术后30d-180d使用)的30例继发性瘢痕秃发患者纳入FUE+PRP组。观察2组患者术后3、6、12个月毛发成活率、患者12个月术后满意率及患者12个月内植发区不良反应发生率。结果 术后3、6、12个月,FUE+PRP组患者成活率分别为(35.7±1.8)%、(79.4±2.5)%、(90.4±2.3)%,明显高于单纯FUE组(25.1±1.9)%、(71.5±2.5)%、GW-572016供应商(83.5±1.8)%。术后12个月,单纯FUE组患者非常满意10例,满意13例,不满意7例。FUE+PRP组skin immunity患者非常满意21例,满意7例,不满意2例。FUE组患者满意率76.7%,FUE+PRP组患者满意率93.3%(P<0.05)。术后12个月内FUE联合PRP治疗组患者植发区皮肤坏死、毛囊炎发生率低于单纯FUE治疗组。但差异无统计学意义(P>0.05)。结论 与单纯的行FUE移植术相比,FUE联合富血小板血浆能有效提高继发性瘢痕秃发患者行FUE移植术后毛发的成活率及患者的满意率,有利于继寻找更多发性瘢痕秃发的治疗。