S6 kinase 信号通路

目的：探讨吴茱萸selleck FUT-175粉贴敷双侧内关穴（PC6）和合谷穴（L14）对血液病患者化疗预后的影响。方法：选择2015年2月-2019年1月新疆兵团第九师医院诊治的急性白血病患者76例，根据随机方法把患者分为贴敷组与对照组，每组各38例。两组分别化疗的同时，对照组给予盐酸格拉司琼注射液治疗；贴敷组在对照组基础上增加吴茱萸粉贴敷双侧内关穴和合谷穴治疗。观察与随访患者的预后。结果：贴敷组治疗期间的恶心呕吐情况好于对照组（P <0.05）。两组治疗后的血清磷酸酶及张力蛋白同源物（Phosphatase and tensin homologs,PTEN）含量高于治疗前（P <0.05），贴敷组高于对照组（P <0.05）。贴敷组治疗Natural infection后的生理功能、躯体疼痛、总体健康等生活质量评分均高于对照组（P <0.05）。所有患者随访到2021年3月1日，平均随访时间为（25.20±3.18）个月，贴敷组的平均生存时间高于对Wnt-C59研究购买照组（P <0.05）。贴敷组仅1例出现轻度皮肤发红伴瘙痒，给予抗过敏治疗后好转，其余均未出现敷贴脱落、皮肤水泡等现象，药物不良反应发生率为2.63%(1/38)。对照组在此期间无不良反应发生。结论：吴茱萸粉贴敷双侧内关穴和合谷穴治疗急性白血病患者能促进血清PTEN释放，有利于缓解恶心呕吐症状，提高患者生活质量，延长患者生存时间。

目的评价使用磁共振图像(Magnetic Resonance Imaging,MRI)的深度学习(Deep Learning,DL)模型在鉴别小肝癌(small-Hepatocellular Carcinoma,s-HCC)与不典型增生结节(Dysplastic Nodules,DNs)中tumor cell biology的应用价值。资料与方法影像学资料获取:本研究回顾性收集了自2012年2月至2022年10月就诊于山东省立医院及原山东省医学影像学研究所148例肝硬化结节患者的有关资料,根据手术或超声穿刺病理结果,分为s-HCC组91例和DNs组57例,收集患者术前MRI平扫序列(T1WI、T2WI)及增强各期序列(动脉期、门静脉期、延迟期、肝胆特异期)。将不同病理类型的病例按照8:2的比例随机分为训练集与验证集。临床资料获取及统计分析:收集148例患者临床特征信息,包括年龄、性别、相关病因(有无肝炎及类型)、有无肝硬化及程度、有无腹水;血清学化验指标:甲胎蛋白(AFP)、异常凝血酶原-Ⅱ(PIVKA-Ⅱ)、糖类抗原125(CA125)、甲胎蛋白异质体L3(AFP-L3)、甲胎蛋白异质体比率(AFP-L3/AFP)、糖类抗原19-9(CA199);组织病理学资料:结节病理类型、结节分化程度以及免疫组化指标(Ki-67+、Glypican-3、Arginase-1);MRI影像信息:结节发病部位、大小、个数并对增强图像特征进行INCB018424 IC50定性评估(动脉期明显强化、门静脉期和(或)延迟期强化低于肝实质、肝胆特异期呈低信号、强化“假包膜”)。对以上资料使用SPSS 27.0版本软件进行统计分析(t检验、卡方分析及Spearman相关性分析),结果以P<0.01认为差异具有显著统计学意义,以P<0.05认为差异具有统计学意义。建立模型与效能检验:将上述所收集的DICOM格式MRI图像导入ITK-SNAP 软件(Version 3.8.0)中进行手动感兴趣区(Region Of Interest,ROI)的勾画,获取标记后mask像,以.NTTFI格式导出。结合3D卷积神经网络(CNN)深度学习技术,选择了 3D-resnet18,3D-resnet34,3D-resnet50三种网络构架,分别结合BCE,MSE,MACompound C NMRE,SMOOTH L1四类损失函数,进行预实验,并筛选网络构架和损失函数最优组合,使用最优组合建立鉴别s-HCC与DNs的3D CNN AI预测模型。利用最优损失函数及AdamW优化算法对模型进行反复训练,用验证集数据对模型效能进行检验,使用5折交叉验证法以准确度、特异度、灵敏度指标为衡量标准来评估所构建预测模型的诊断效能。结果患者临床影像资料t检验及卡方检验统计分析显示:AFP、AFP-L3/AFP、PIVKA-Ⅱ、动脉期明显强化、门静脉期和(或)平衡期强化低于肝实质、肝胆期特异期呈低信号,这七项临床及影像指标在s-HCC组与DNs组差异具有统计学意义(P<0.05)。患者性别、年龄、肝硬化病因、肝硬化程度及强化“假包膜”这五项临床变量资料差异在两组间均无统计学意义(P>0.05)。对差异有统计学意义指标进行Spearman相关分析显示:肝胆特异期呈低信号与DNs组和s-HCC组之间关系为呈正性强相关;动脉期明显强化、门静脉期和(或)延迟期强化低于肝实质与两组呈正性中等程度相关,而血清学指标AFP、AFP-L3/AFP、PIVKA-Ⅱ与两组呈正性弱相关。3D-Resnet18网络架构结合BCE损失函数得到的模型准确度最高,结合两者建立了基于CNN的3D-Resnet18 AI预测模型,经过5折交叉验证测试,结果显示模型准确度最高值为0.864,最低值为0.692,平均准确度为0.7698±0.02914(95%CI,0.6889～0.8507),特异度为 0.7890,灵敏度为 0.7052。结论通过利用DL算法提取磁共振影像信息特征,建立3D-Resnet18 AI预测模型可有效实现对s-HCC与DNs的鉴别。通过对s-HCC与DNs患者术前临床影像资料特征的统计分析,得出肝胆特异期呈低信号与DNs和s-HCC具有正性强相关,可辅助临床医师对两者进行鉴别。本研究对三种网络构架(3D-Resnet18、3D-Resnet34、3D-Resnet50)进行初筛测试,证明了在数据集相对较少的分类任务上,较浅层的网络构架(3D-Resnet18)更容易学习到数据特征从而实现对样本的准确分类。

目的 探究临床常用的3种不同方法全自动自身抗体分析仪检测抗核抗体谱结果的差异。方法 选取2021年4月至5月在蚌埠医学院第一附属医院确诊为系统性自身免疫病（autoimmune disease,AID）的患者72例作为AID组，留取患者相关项目检测剩余的血清样本72份，同时按照性别相同、年龄相近的原则，选取同期体检无AID的31例健康者作为对照组，留取血清样本31份。采用目前临床常用的进口全自动流式点阵发光免疫分析仪（方法 A）、国产全自动流式荧光发光分析仪（方法 B）和多重液相芯片免疫分析仪（方法 C）分别检测两组患者血清样本中的10种抗核抗体，比较3种方法的检测阳性率，分析其阳性符合率、阴性符合率、敏感度、特异性等。为了帮助选择出对临床检验更可靠的方法学及检验设备，对3种方法进行两两比较，进行一致性评价。结果 方法 A、B和C与间接免疫荧光法检测的AID组阳性检出率均显著高于对照组（P<0.05）。采用方法 A、B和C检测对照组10种抗体的结果均为阴性，AID组购买SAG10种抗体检测结果中，方法 B、C检测抗Sm抗体和抗SSA60抗体的阳性率均显著低于方法 A(P<0.05),3种方法检测的其他抗体阳性率比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。在方法 A与方法 B的一致性分析中，二者的平均符合率为92.22%，有1项一致性差，3项一致性一般，6项一致性好；方法 A与方法 C的一致性分析中，二者的平均符合率为93.89%，有5项一致性一般，5项一致性好；方法 B与方法的一致性分析中，二者的平均符合率为92.65%。有1项一致性差，4项一致性一般，5项一致性好。结论 目前两种国产品牌的全自动流式荧光发光分析仪和多重液相芯片免疫分析仪与进口全自动流式点阵发光免疫分析仪检测自身抗体总符合率较高，但是biomass additives检测血清抗SmProtein Tyrosine Kinase抑制剂抗体的一致性较差，应密切结合临床与其他实验室指标综合判断。

组胺(HA)是具有强毒性和潜在致癌性的一种生物胺(BAs),摄入一定量后会引起一系列中毒反应甚至危及生命。HA广泛存在于水产品、肉制品、发酵制品等各类食品中,常作为评价食品品质的关键指标。因此开发HA的快速检测方法可以为食品加工和贮藏工艺的安全性提供技术支持。表面增强拉曼光谱(SERS)作为一种与纳米技术相结合的振动光谱技术,能够提供丰富的化学分子指纹信息,具备操作便捷、荧光背景低等优势。在SERS分析领域,制备具有优异传感性能的SERS活性基底是获得高质量谱图的关键所在。尽管现阶段所开发的三类基底具备不同优势,如纳米溶胶基底制备简单、固相基底适用性高、功能性基底性能多样,但它们在检测模式和适用性等方面仍需不断改进和提升。因此,本论文基于金属有机框架(MOFs)的多元化结构与功能精确调控SERS基底构造,采用不同类型的信号定量模式以改善三类传统SERS基底中所存在的技术问题,提高不同体系中HA检测的适用性,同时在提高方法灵敏度及特异性方面不断进行基底的优化。主要内容包括:1、基于ZIF-67的高稳定性及信号增强能力,构建一种准确检测HA的比率型SERS传感器,以改善溶胶基底均匀性不佳及易聚集的问题。以金纳米花(Au NFs)为内核、ZIF-67为壳层合成核壳型纳米溶胶SERS基底(Au NFs@ZIF-67),并采用4-巯基PUN30119配制苯甲酸(4-MBA)作为HA的识别分子及信号校正内标(IS)。在检测体系中,HA浓度的升高会导致其拉曼特征峰信号强度(I_(1172))升高,而4-MBA信号强度(I_(1074))保持相对稳定。结果表明,HA和4-MBA的拉曼信号比率值(I_(1172)/I_(1074))与HA浓度的对数值在10~(-7)M到10~(-3)M的线性范围内呈正相关(拟合优度R~2=0.993),检出限(LOD)为0.87×10~(-7)M,加标鲈鱼样品回收率为93.42%至102.23%,并且该方法实现了对鱼类腐败过程的有效监控。2、基于IRMOF-3的功能可调性及高负载能力,Biologic therapies开发一种高特异性检测HA的间接定量型SERS传感器,以提高固相基底的样品采集密度及环境耐受性。IRMOF-3上原位合成金纳米粒子(Au NPs),并以聚二甲基硅氧烷膜(PDMS)作为载体制备SERS基底(IRMOF-3@Au/PDMS)。5,5′-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)嵌入具有核壳结构的金银纳米棒(Au NR@Ag),用组胺适配体(HA apt)进行功能化以构建信号探针(Au NR-DTNB@Ag-HA apt)。SERS基底与信号探针通过HA apt与IRMOF-3之间的π-π相互作用进行偶联组装。在检测体系中,基于HA与HA apt的高Alisertib生产商亲和力,部分信号探针从SERS基底上脱离,导致DTNB信号强度(I_(1331))下降。结果表明,I_(1331)与HA浓度的对数值在9.0×10~(-9)M到3.6×10~(-3)M的线性范围内呈负相关(R~2=0.990),LOD值为3.23×10~(-10)M,加标葡萄酒样品的回收率为95.90%至101.00%。3、基于MIL-100(Fe)的优良类过氧化物酶活性,设计一种快速检测HA的信号输出型SERS传感器,以简化功能性基底的制备流程并提升分析效率。MIL-100(Fe)上负载Au NPs形成复合纳米酶MIL-100(Fe)@Au NPs,作为3,3′,5,5′-四甲基联苯胺/过氧化氢(TMB/H_2O_2)体系中催化反应的“催化剂”,同时合成银纳米粒子(Ag NPs)作为体系中催化产物ox TMB信号输出的“放大剂”。二者经核酸功能化后,通过核酸链碱基互补配对的方式进行组装,形成“卫星”组装体。检测体系中,HA与HA apt的特异性结合诱导MIL-100(Fe)@Au NPs上Ag NPs的组装量降低,ox TMB信号强度(I_(1604))相应降低。结果表明,I_(1604)与HA浓度的对数值在10~(-11)M到0.5×10~(-2)M的线性范围内呈负相关(R~2=0.996),LOD值低至0.39×10~(-11)M,加标发酵豆制品的回收率为94.42%至105.75%。

目的:探讨热休克蛋白70蛋白5(heat shock 70 kDa protein 5,HSPADinaciclib小鼠5)通过铁死亡对宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响。方法:实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹法(Western Blot, WB)检测HSPA5和谷胱甘肽过氧selleck产品化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)在宫颈癌和癌旁组织中的表达情况，通过TCGA数据库分析所有宫颈鳞状细胞癌和宫颈内膜腺癌(CESC)中HSPA5与患者总生存率间的相关性。体外培养人宫颈癌HeLa和SiHa细胞系，分别感染shHSPA5和shCtrl慢病毒，构建稳定的宫颈癌HSPA5敲低株，用qRT-PCR和WB检测HSPA5敲低之后铁死亡相关蛋白GPX4的表达情况。使用铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1)或激活剂Erastin处理细胞后，采用CCK-8和EdU检测细胞增殖情况；乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测LDH含量；还原型谷胱甘肽(GSH)试剂盒和丙二醛(MDA)试剂盒分别测定GSH和MDA含量；流式细胞术检测细胞凋亡及活性氧(ROS)的情况。结果:与癌旁组织相比，宫颈癌组织中HSPA5与GPX4的表达显著升高，HSPA5高表达与患者预后不良有关；在HeLa和SiHa细胞中敲低HSPA5能够抑制细胞的增殖和促进细胞凋亡；同时细胞内ROS、MDA和LDH的水平上调；HSPA5敲低后GPX4的mRNA和蛋白表达水平同时降低，此外细胞内GSH的含量降低；铁死亡抑制剂Fer-1逆转了HSPA5敲低导致的ROS和LDH的含量升高并抑制细胞凋亡；铁死亡激活剂Erastinskin and soft tissue infection和HSPA5敲低联合增加了细胞凋亡并抑制细胞增殖。结论:HSPA5在宫颈癌组织中表达上调，通过敲低HSPA5可激活铁死亡从而抑制宫颈癌细胞的增殖和促进细胞凋亡。

近年来由于饮食结构的改变,导致人群营养过剩而引起www.selleck.cn/products/imidazole-ketone-erastin代谢功能障碍,其中脂质代谢障碍会对机体产生脂毒性。营养干预对于许多代谢功能障碍具有改善作用,常见的方式是利用天然的生物活性效应物进行干预,从而起到调控作用。脂毒性的毒性作用通常与氧化应激反应的激活有关,因此使用具有调节应激反应的活性物质进行营养干预可能是改善脂毒性的有效手段。前期研究表明米糠肽KF-8具有良好的抗氧化活性。基于此,推测使用米糠活性肽进行营养干预可以改善应激反应的过度激活,缓解脂毒性。本文使用脂肪酸诱导构建了秀丽隐杆线虫和HepG2细胞的脂毒性模型,以米糠活性肽为效应物进行营养干预,探究了米糠活性肽对脂毒性的调控作用及其作用机理,主要研究结果如下:1、不同的米糠活性肽清除DPPH、ABTS自由基的能力、氧自由基吸收能力和CAA值都随浓度的增加而相应增加,筛选出KE-7和KF-8两条肽较其他四条更具有改善应激反应过度激活的优势。2、饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸都controlled infection能诱导脂毒性的产生,但相较于油酸和亚油酸,1 mM棕榈酸不仅能使秀丽隐杆线虫的脂滴表达显著增多,而且能使氧化损伤标志物ROS的表达水平明显升高。3、3 mM的棕榈酸诱导秀丽隐杆线虫形成脂毒性的模型更稳定,其不仅能使脂滴表达和甘油三酯水平升高,更能引起持续的氧化损伤。棕榈酸使ROS、MDA表达水平上升,抗氧化酶(SOD、CAT)活性下降且总抗氧化能力下降。棕榈酸还能引起由脂毒性带来的寿命缩短,并且使爬行和头部摆动频次下降。研究发现给予KE-7和KF-8都能显著降低脂质堆积,并使ROS和MDA的表达水平显著下降,且能显著增加抗氧化酶的活性,使线虫正常行为学指标得到改善。4MEK抑制剂、棕榈酸诱导HepG2细胞形成脂毒性,发现100μM的棕榈酸就能显著引起脂毒性。而在给予50μg/mL的KE-7和KF-8后都能显著降低脂滴的形成、甘油三酯、总胆固醇的表达。此外,还能显著减少ROS和MDA的表达量,同时提高SOD、CAT的酶活力和总抗氧化能力。5、在使用两种不同模型后,对其机理进一步研究。棕榈酸通过下调SCD1使饱和脂肪酸不能进行去饱和,而进入脂质积累途径,DGAT表达升高,脂质堆积。脂质过度积累会引起脂质分解进行代偿性变化,PPAR表达上升,脂质进入脂肪酸氧化途径。但同时CPT的表达下降,又会使脂肪酸氧化途径受阻,由此产生了脂毒性,使机体氧化损伤程度加深。而进行米糠活性肽干预后,能使其相应基因和蛋白的表达水平恢复正常,促使代谢正常最终改善脂毒性。通过研究,本文得出以下结论:(1)米糠活性肽KE-7和KF-8具有良好的抗氧化效果;(2)相较于不饱和脂肪酸,棕榈酸更易形成脂毒性;(3)米糠活性肽KE-7和KF-8可以缓解棕榈酸引起的脂毒性;(4)米糠活性肽KE-7和KF-8通过调节DGAT-PPARα-CPT通路,使秀丽隐杆线虫和HepG2细胞恢复正常的脂质代谢水平,延缓毒性作用。本课题为米糠活性肽抗脂毒性相关研究提供了新的理论依据,为以米糠活性肽为代表的副产物的综合利用提供了理论参考。

目的:比较经尿道等离子前列腺电切术与经尿道等离子前列腺剜除术联合电切术在高原地区对藏族同胞良性前列腺增生(BPH)的临床疗效及安全性。方法:收集2021年1月—2022年12月于拉萨市人民医院就诊的BPH患者，入组符合条件的60例患者。随机分入单纯前列腺电切术组(电切组)和前列腺剜除术联合电切术组(联合组),每组30例。收集围手术期资料包括年龄、前列腺体积、前列腺特异性抗原(PSA)水平、国际前列腺症状(IPSS)评分、最大尿流率(Q_(max))、ECOG评分、手术时间、住院时间、留置尿管时间、中叶突出程度、血红蛋白下降程度、术后并发症情况等。在术后1、3、6个月时进行随访，包括并发症、尿控恢复情况、术后IPEmpagliflozinSS评分及术后PSA评分。结果:电切组和联合组在患者年龄、前列腺体积、术前IPSS评分、Q_(max)、ECOG评分、中叶突出程度、血红蛋白下降程度、术前PSA水平、手术时间、术后并发症、术后尿控方面比较差异无统计学意义；在住院时间及导尿管留置时间上，电切组较联合组略有优势；随访方面，2组术后IPSS评分及改善vaccine and immunotherapy程度差异无统计学意义，而联合组PSA在术后1个月时有一定优势，但在后续随访中2组差异无统计学意义。结论:经尿道等离子前列腺FUT-175剜除术联合电切术在临床疗效及安全性方面不劣于被视为金标准的经尿道等离子前列腺电切术。且该术式不需另购器械，更易学习掌握，适宜在西藏高原地区和边远基层地区大力推广。

目的:对洛铂或卡铂联合紫杉醇用于输卵管癌及上皮性卵巢癌术后初治化疗患者的临床近远期疗效以及不良反应进行对比分析,进一步证实洛铂用于输卵管癌及上皮性卵巢癌术后化疗的有效性及安全性。方法:选取2015年1月-2021年12月大连医科大学附属第一医院妇科住院并接受洛铂或卡铂联合紫杉醇术后化疗的患者共68例,其中洛铂联合紫杉醇组患者26例,卡铂联合紫杉醇组患者42例。接受3次化疗疗程后,根据CA125值及全腹CT测量盆腹腔残余肿瘤大小变化来评估其早期临床疗效。对所有入组患者进行了随访,并记录患者死亡日期、失访日期。以疾病无进展生存期(progression free survival,PFS)评Infectious causes of cancer价患者的远期疗效,并用单因素及多因素分析探索影响患者PFS的相关因素。按NCI-CTCAEPidnarulex MW 5.0标准评价标准评价药物副反应。结果:1.洛铂联合紫杉醇组及卡铂联合紫杉醇组的ORR分别为71.4%(10/14)及82.6%(19/23),两组的DCR分别为85.7%(12/14)及95.7%(22/23),组间比较均无统计学差异(P>0.05);2.两组患者CA125初始值无统计学差异(P=0.594),第1疗程后洛铂及卡铂组CA125转阴率分别为35.7%(5/14)及60.9%(14/23),两组间比较无统计学差异(P=0.184);第三疗程后洛铂及卡铂组CA125转阴率分别为85.7%(12/14)及91.3%(21/23),两组间亦无统计学差异(P=0.625);3.洛铂联合紫杉醇组mPFS为28.0个月(95%CI,4.5-51.5个月);卡铂联合紫杉醇组因随访结束时超过一半患者未发生疾病进展或死亡,因此无法计算mPFS。两组PFS比较P=0.108,差异无统计学意义;因I期患者均未复发,排除I期患者后对两组mPFS再次分析,洛铂组mPFS为18.0个月(95%CI,9.3-26.7个月);卡铂组mPFS为31个月(95%CI,10.3-51.7个月),两组比较P=0.281。4.根据单因素及多因素分析结果,影响此研究模型PFS的独立预后因素为手术是否达到R1(P=0.048),手术未达R1的患者复发风selleckchem Telaglenastat险是达到R1患者的2.332倍;5.洛铂与卡铂组白细胞及粒细胞减少的发生率无显著差异,但洛铂组1-2级粒细胞减少的发生率较卡铂组更高(57.7%vs 20.6%,P=0.03),而3-4级粒细胞减少的发生率较卡铂组更低(42.3%vs 76.5%,P=0.007)。洛铂组血小板减少的总体发生率较卡铂组更高(42.3%vs 14.3%,P=0.010),且洛铂组1-2级血小板减少的发生率更高(30.8%vs 9.5%,P=0.046),但两组间3-4级血小板减少的发生率间无差异(11.5%vs 4.8%,P=0.363)。两组患者肝功能损害、恶心呕吐等不良反应发生率相似(P>0.05)。结论:1、洛铂或卡铂联合紫杉醇用于输卵管癌及上皮性卵巢癌术后初治均显示了良好的疗效,二者近期疗效相当,远期疗效洛铂组低于卡铂,但两组间无统计学差异;2、洛铂及卡铂均以骨髓抑制为最常见的不良反应,但卡铂发生3-4级中性粒细胞的可能较洛铂更高;而洛铂发生血小板减少的可能性较卡铂更高,但多集中于1-2级血小板减少。

在肿瘤治疗中,单一疗法往往具有局限性,治疗疗效与结果也不尽人意。将化疗、放疗、手术、生物治疗等疗法联合使用,可起到协同抗癌效果,延缓肿瘤生长,增强抗癌作用的同时降低毒副作用。其中,化疗和免疫疗法的联合是一种常见联合治疗策略,二者可以起到相互促进的协同抗癌作用。然而,小分子化疗药物和免疫治疗的基因药物在复杂的生理环境内面临多重屏障,极易被水解或清除,很难靶向到达肿瘤部位,且多数化疗药物具有较大的毒副作用。因此,将智能纳米递送系统用于联合治疗增强疗效与抗肿瘤作用具有重要的研究意义和临床应用价值。纳米颗粒进入人体后,会面临多重生物屏障,如何针对不同阶段生理障碍的特性设计出高效低毒且靶向性强的纳米递送系统仍然面临着巨大挑战。本论文构建了基于血液、肿瘤组织以及细胞递送阶段具备不同特性的纳米纳米递送系统(HA/P-A cluster),共载化疗药物阿霉素(Doxorubicin,DOX)和免疫阻断抑制剂(p PD-L1 trap)。该纳米集簇初始尺寸约为180 nm,能够避免药物在血液中被清除,同时延长药物体内半衰期;达到肿瘤组织后,纳米集簇被肿瘤组织中高表达的金属机制蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMP)裂解为尺寸约为10 nm的小粒径纳米颗粒,増强药物在肿瘤组织中的渗透并且促进肿瘤细胞摄取DOX和p PD-L1 trap质粒。在肿瘤细胞中,纳米颗粒能够快速释放药物,DOX作用于癌细胞的DNA,将冷肿瘤转换为热肿瘤,诱导肿瘤细胞发生免疫原性死亡(Immunogenic cell death,ICD)并释放损伤分子相关模式(Damage-associated molecular patterns,DAMPs);p PD-L1 trap指导肿瘤细胞原位表达PD-L1 trap蛋白,该蛋白阻断PD-1/PD-L1通路,有效减轻PD-1+T细胞的免疫抑制状态,同时减少自身免疫症状的发生;二者联合使用,通过靶向递送到肿瘤部位,在诱导肿瘤细胞发生ICD的同时阻断PD-L1通路,杀灭肿瘤细胞并激活机体抗肿瘤免疫,起到“1+1>2”的协同抗癌作用。在第一章,制备了HA/P-A cluster纳米集簇并对其进行表征,对该纳米集簇的相关理化性质进行检测。首先,将DOX物理包封于小粒径阳离子聚合物PAMAM的疏水空腔内,通过调节二者的比例得到粒径为10 nm,带正电,分散性好且载药率为23.53%的小尺寸纳米颗粒PAMAM@DOX。随后,通过层层自组装法获得纳米金PEI复合物(Au PEI),该纳米颗粒粒径约为8 nm,带正电。通过静电吸附将免疫治疗Pidnarulex抑制剂的基因药物p PD-L1 trap质粒负载于Au PEI表面得到Au-p PD-L1 trap,其粒径仍为8 nm。最后,以SMCC作为交联剂,通过MMP敏感的双功能肽R14将两种小粒径纳米颗粒交联为立体网状纳米集簇,用透明质酸(Hyaluronic acid,HA)对纳米集簇进行包覆得到粒径为180 nm,带负电的纳米集簇(HA/P-A cluster)。HA/P-A cluster在低p H下可以缓释化疗药物DOX,且其粒径在体外7天内无明显变化,较为稳定。此外,该纳米集簇能够有效缩合DNA,且溶血率在实验涉及的浓度下小于5%,安全性良好。在第二章中,对纳米集簇的体外体外抗肿瘤效果与生物学作用进行研究。首先通过流式细胞术与共聚焦显微镜,考察了纳米集簇的细胞摄取,对比游离p PD-L1trap与DOX,纳米集簇的细胞摄取量明显增多。通过MTT法与凋亡试剂盒评价纳米集簇诱导肿瘤细胞凋亡的能力,结果显示,纳米集簇可以有效诱导B16-F10细胞凋亡,细胞毒性与凋亡结果趋势一致。为了验证纳米集簇诱导肿瘤细胞发生ICD的能力,检测纳米集簇处理细胞后ICD标志分子钙网蛋白(Calreticulin,CRT)和热休克蛋白(Heat shock protein 90,HSP 90)的表达,流式细胞术与免疫荧光法结果均显示,纳米集簇可以诱导肿瘤细胞高表达CRT和HSP 90,这表明纳米集簇可以高效诱导肿瘤细胞发生ICD。采用ELISA和化学发光法分别检测纳米集簇处理后肿瘤细胞高迁移率族蛋白HMGB1和ATP的释放,结果显示,纳米集簇处理后小鼠黑色素瘤细胞B16-F10释放到胞外的HMGB1和ATP含量大幅增加。此外,HA/P-A cluster还可以诱导B16-F10细胞表面MHC-I的表达,这意味着纳米集簇不仅可以诱发ICD,还能诱导细胞识别和呈递内源性抗原肽。最后,以GFP作为报告基因验证纳米集簇的体外基因转染效率,结果显示,纳米集簇的转染效率随着质量比的增加呈现先增加后减小的趋势,在30:1达到最佳。使用His标记的ELISA试剂盒检测这一比例下纳米集簇对p PD-L1 trap的转染效率,结果表示HA/P-A cluster可以有效转染p PD-L1 trap,诱导细胞表达PD-L1 trap蛋白,且随着纳米颗粒作用时AMPK抑制剂间的延长,PD-L1 trap蛋白的累积释放量显著增加。在第三章中,首先构建了B16-F10细胞的小鼠荷瘤模型。定期记录治疗期间小鼠肿瘤体积和体重的变化,治疗结束三天后,处死小鼠并切除肿瘤组织与主要器官进行检测。结果显示HA/P-A cluster治疗可以有效延缓肿瘤生长,该组小鼠肿瘤体积小,瘤重轻,细胞凋亡数量多,抗癌效果显著。通过H&E染色验证了纳米集簇的生物安全性,HA/P-A cluster对小鼠主要器官无毒副作用,治疗期间小鼠体重变化不明显。通过免疫荧光法与流式细胞术对肿瘤组织进一步分析发现,纳米集簇的治疗增加了肿瘤组织中CD8+T细胞的浸润,进一步印证了纳米集簇有效激活了机体的抗肿瘤免疫。综上,本课题构建了一种肿瘤微环境响应型纳米集簇,外包裹的HA增加了纳米集簇的稳定性,有助于纳米集簇实现体内长循环,此外,HA还与肿瘤细胞表面高表达的CD44相互作用进而主动靶向至肿瘤部位。HA/P-A cluster(180 nm)蓄积于肿瘤部位后,纳米集簇被MMP水解为两种粒径约为10 nm的小颗粒(PAMAM@DOX和Au-p PD-L1 trap)并经R14靶向介导进入肿瘤细胞。随后,纳米集簇负载的化疗药物DOX与免疫治疗基因药物PD-L1 trap在肿瘤细胞内发挥协同抗肿瘤作peripheral pathology用。体内和体外实验结果都表明,纳米集簇可以有效诱导肿瘤细胞凋亡,延缓肿瘤生长,增加肿瘤部位CD8+T细胞的浸润,激活机体抗肿瘤免疫,通过协同效应增强癌症治疗效果,为设计和研发基于尺寸可变的纳米集簇提供技术路径,也为提升化学免疫治疗在抗肿瘤中的应用提供策略。

目的:糖尿病是全球范围内十大死亡原因之一,心血管并发症是糖尿病最为严重的并发症。长期高血糖及高游离脂肪酸通过多种代谢途径,致内皮细胞产生大量活性氧自由基,诱导氧化应激反应及功能障碍,是糖尿病血管损伤的重要环节。铁死亡是一种新近发现的铁依赖性的脂质过氧化诱导的细胞死亡,而线粒体外膜铁硫簇蛋RP56976临床试验白mitoNEET在氧化状态下可介导线粒体铁转运,其是否介导线粒体途径铁死亡致糖尿病血管损伤尚有待阐明auto-immune response。方法:本研究通过对比糖尿病小鼠(db/db小鼠)与对照组小鼠(WT小鼠)的血糖、血脂、糖耐量、内皮依赖性舒张功能、血管组织形态、活性氧(ROS)生成、电镜下线粒体形态等,明确糖尿病中血管损伤特征;进一步给予db/db小鼠铁死亡抑制剂(Fer-1)、线粒体抗氧化剂(mitoTEMPO)、铁螯合剂(DFO)等药物干预,观察干预线粒体途径铁死亡对db/db小鼠血管损伤的影响;最后,阐明高糖高脂损伤的内皮细胞中mitoNEET上调致铁死亡标志分子GPX4的表达、细胞ROS生成及线粒体功能的变化情况,揭示其通过线粒体途径铁死亡致糖尿病血管损伤的作用及机制。结果:糖尿病小鼠中存在着血管结构和功能损伤:小鼠血糖、血脂升高、糖耐量异常(P<0.01),内皮依赖性血管舒张功能受损(P<0.01);血清内皮素1(ET-1)含量升高(P<0.01);形态学结果显示小鼠降主动脉组织结构紊乱、ROS生成增加(P<0.01),线粒体结构受损。加入铁死亡抑制剂、线粒体抗氧化剂、铁螯合剂等干预线粒体氧化与抗氧化的试剂后,可有效缓解糖尿病状态下的血管损伤,尤其是加入铁死亡抑制CH-223191作用剂Fer-1后,虽然干预组小鼠血糖无明显变化,但糖耐量、内皮依赖性血管舒张功能均得到改善(P<0.05),且血清ET-1含量降低(P<0.05);形态学结果显示:加入Fer-1、mitoTEMPO及DFO后,小鼠降主动脉组织结构排列更为整齐,纤维化程度减轻,组织ROS生成减少(P<0.01),线粒体结构的损伤得到一定程度的恢复。mitoNEET作为线粒体外膜上转运铁的关键分子,在高糖高脂损伤的内皮细胞模型中基因(P<0.01)和蛋白(P<0.01)高表达,且细胞铁死亡关键因子GPX4的基因表达降低(P<0.05),细胞ROS生成增加(P<0.001),线粒体膜电位有降低趋势;而给予铁死亡抑制剂、线粒体抗氧化剂、铁螯合剂等药物干预后,细胞中mitoNEET基因表达及蛋白表达均降低(P<0.05),GPX4基因表达升高(P<0.05),内皮细胞铁死亡得到抑制;ROS减少(P<0.001),线粒体膜电位升高(P<0.05),线粒体功能得到改善。结论:糖尿病小鼠血管中存在结构和功能损伤,铁死亡是造成该损伤的原因之一;铁死亡抑制剂等可通过抑制铁死亡减轻糖尿病血管损伤;mitoNEET作为线粒体铁转运的关键分子介导了高糖高脂环境下内皮细胞铁死亡,加速血管的结构改变及功能损伤。