研究背景和目的脓毒症是感染反应失调引起的危重疾病,可以导10致危及生命的器官功能障碍,是重症监护室(Intensive Care Unit,ICU)内患者死亡的主要原因之一。现有的脓毒症诊断标准复杂耗时,尚未发现具有独立诊断能力的生物标志物。本实验室前期研究显示脂肪因子Meteorin-like(METRNL)与脓毒症密切相关,本课题将从整体动物水平和临床患者水平研究METRNL作为脓毒症诊断与病情预测标志物的潜能,并初步探究METRNL的分泌机制,以期发现新的脓毒症候选标志物,为临床提供脓毒症的诊疗依据,为阐明脓毒症的发病机制提供新的思路。研究方法1.利用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)腹腔注射和盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)两种动物脓毒症模型,探索小鼠血清Metrnl的变化规律,在整体动物水平探索血清Metrnl作为脓毒症诊断与病情预测标志物的潜能。2.纳入现行经典脓毒症参考指标降钙素原(Procalcitonin,PCT)和C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)评估METRNL对术后脓毒症患者的诊断与病情预测潜能。首先探索对照组患者手术前后血清METRNL的差异,而后将对照组样本与术后脓毒症患者首次样本的血清METRNL、PCT、CRP进行比较,分别绘制受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve,ROC曲线)并得出曲线下面积(Area Under ROC Curve,AUC),根据约登指数得出截断值及相应敏感性和特异性,再将所有术后脓毒症样本的METRNL、PCT、CRP与代表脓毒症严重程度的贯序器官衰竭评估(Sequential Organ Failure Assessment,SOFA)评分进行整体相关性分析,之后进行术后脓毒症患者的个体化相关性分析,最后对血清METRNL、PCT、CRP与术后脓毒症患者28天生存情况进行Logistic回归分析。3.纳入现行经典脓毒症参考指标PCT和CRP评估METRNL对ICU内脓毒症患者的诊断与病情预测潜能。首先将对照组患者与ICU内脓毒症患者的血清METRNL、PCT、CRP进行比较,分别绘制ROC曲线并得出AUC,根据约登指数得出截断值及相应敏感性和特异性,再将ICU内脓毒症样本的METRNL、PCT、CRP与SOFA评分进行相关性分析,最后对血清METRNL、PCT、CRP与ICU内脓毒症患者28天生存情况进行Logistic回归分析。4.初步探索METRNL的分泌机制。利用LPS腹腔注射和CLP两种造模方式对内皮细胞特异性Metrnl基因敲除(endothelial cell-specific Metrnl gene knockout mice,EC-Metrnl~(-/-))小鼠及同窝野生型(wild type,WT)小鼠造模,探索生理及脓毒症状态下小鼠血清Metrnl的主要组织来源。利用LPS探索脓毒症状态下原代人脐静脉内皮细胞(HumanColforsin配制 umbilical vein endothelial cell,HUVECs)上清液METRNL的变化规律及胞内METRNL m RNA表达情况。使用特异性阻断分泌蛋白由内质网向高尔基体转运的阻断剂Brefeldin A,和特异性阻断内质网膜转运通道构建的Eeyarestatin 1,在生理状态和脓毒症状态下探索METRNL的细胞水平Bionanocomposite film分泌途径。研究结果1.LPS腹腔注射诱导的脓毒症模型造模2 h后,LPS给药剂量为10~(-2)mg/kg、10~(-1)mg/kg、1 mg/kg、10 mg/kg的实验组小鼠血清Metrnl显著高于对照组小鼠,实验组小鼠血清Metrnl存在随着LPS剂量的增加而不断升高的量效关系。浓度低至10~(-4)mg/kg的LPS腹腔注射即可引起小鼠血清Metrnl显著升高。1 mg/kg的LPS腹腔注射造模1 h后,实验组小鼠血清Metrnl即出现显著升高,实验组小鼠血清Metrnl存在随着造模时间延长而升高的时效关系。1 mg/kg的LPS腹腔注射造模0.5 h后,实验组小鼠血清Metrnl未出现显著升高。CLP诱导的脓毒症模型造模2 h、6 h、12 h、24h、48 h后所有实验组小鼠血清Metrnl显著高于相应假手术组小鼠,实验组小鼠血清Metrnl存在随着造模时间延长而不断升高的时效关系。2.大型腹部外科手术轻度升高血清METRNL。血清METRNL诊断术后脓毒症的AUC略逊色于PCT但优于CRP(AUC=0.958:0.997:0.882)。术后脓毒症患者血清METRNL与SOFA评分相关(肯德尔检验相关系数0.577,P<0.01;斯皮尔曼检验相关系数0.759,P<0.01),PCT与SOFA评分相关(肯德尔检验相关系数0.407,P<0.01;斯皮尔曼检验相关系数0.504,P<0.01),CRP与SOFA评分无相关性。个体化相关性分析中,所有患者血清METRNL和PCT均与SOFA评分相关,有2名患者的血清CRP与SOFAJQ1小鼠评分相关。血清METRNL对术后脓毒症患者28天生存情况的影响具有统计学意义(优势比1.009,95%置信区间1.002-1.016,P=0.0135),血清PCT和CRP对术后脓毒症患者28天生存情况的影响不具有统计学意义。3.血清METRNL诊断ICU内脓毒症的AUC略逊色于PCT但优于CRP(AUC=0.973:0.99:0.926)。ICU内脓毒症患者血清METRNL与SOFA评分相关(肯德尔检验相关系数0.701,P<0.01;斯皮尔曼检验相关系数0.856,P<0.01),PCT与SOFA评分相关(肯德尔检验相关系数0.302,P<0.05;斯皮尔曼检验相关系数0.504,P<0.05),CRP与SOFA评分无相关性。血清METRNL对ICU内脓毒症患者28天生存情况的影响具有统计学意义(优势比1.007,95%置信区间1.002-1.012,P<0.001),血清PCT和CRP对ICU内脓毒症患者28天生存情况的影响不具有统计学意义。4.生理盐水腹腔注射EC-Metrnl~(-/-)小鼠及WT小鼠2 h后,EC-Metrnl~(-/-)小鼠血清Metrnl低于酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)试剂盒检测下限,其水平显著低于WT小鼠。1 mg/kg的LPS腹腔注射EC-Metrnl~(-/-)小鼠及WT小鼠2 h后,EC-Metrnl~(-/-)小鼠血清Metrnl约为WT小鼠的18%。腹腔注射LPS的EC-Metrnl~(-/-)小鼠血清Metrnl高于腹腔注射生理盐水的EC-Metrnl~(-/-)小鼠。CLP模型假手术处理EC-Metrnl~(-/-)小鼠及WT小鼠造模24 h后,EC-Metrnl~(-/-)小鼠血清Metrnl约为WT小鼠的10%。CLP处理的EC-Metrnl~(-/-)小鼠及WT小鼠造模24 h后,EC-Metrnl~(-/-)小鼠血清Metrnl约为WT小鼠的6%。CLP处理的EC-Metrnl~(-/-)小鼠血清Metrnl高于假手术处理的EC-Metrnl~(-/-)小鼠。5.LPS孵育HUVECs 2 h后,LPS浓度为10~(-3)μg/m L、10~(-2)μg/m L、10~(-1)μg/m L、1μg/m L、10μg/m L的实验组HUVECs上清液METRNL显著高于对照组,实验组上清液METRNL存在随着LPS浓度增加而不断升高的量效关系。1μg/m L的LPS孵育HUVECs 0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h后,所有实验组HUVECs上清液METRNL均高于相应对照组,实验组细胞上清液METRNL存在随着造模时间延长而升高的时效关系。各实验组与相应对照组间的METRNL m RNA表达无统计学差异,各实验组间的METRNL m RNA表达也无统计学差异。生理状态的分泌途径研究中,Brefeldin A组细胞的上清液METRNL约为空白对照组和溶剂对照组的10%,Eeyarestatin 1组细胞的上清液METRNL约为空白对照组和溶剂对照组的20%。去除Brefeldin A的阻断后其METRNL恢复至正常。脓毒症状态的分泌途径研究中,LPS+Brefeldin A组上清液METRNL约为LPS组的8%。研究结论1.整体动物实验提示,血清Metrnl具有对脓毒症的早期诊断潜能和病情预测潜能。2.大型腹部外科手术是影响血清METRNL的独立因素。METRNL对术后脓毒症患者和ICU内脓毒症均有较好的诊断潜能和病情预测潜能,可作为脓毒症的候选生物标志物。3.生理和脓毒症状态下的血清Metrnl主要来源于血管内皮,其分泌机制可能通过内质网-高尔基体途径介导。脓毒症状态下升高的METRNL主要来自于已合成蛋白的分泌。