研究背景:银屑病是一种免疫介导的慢性炎症性疾病,常发生在皮肤、指甲和关节等部位,全球患病率为2%至4%。银屑病的特征性皮损为银白色鳞屑性红色斑块,该病病程长、易复发、难治愈,严重影响患者的生活质量。目前认为银屑病是在一定的遗传背景下,受环境因素刺激,免疫细胞及其分泌的细胞因子与角质形成细胞相互作用,导致角质形成细胞过度增殖、异常分化和一系列炎症反应。这一病理过程中涉及各种免疫细胞、免疫分子、细胞因子、趋化因子、细胞内信号传导通路等多种因素,形成一个错综复杂的炎症调控网络,决定了银屑病发病和治疗的复杂性。然而目前银屑病的发病机制未完全明确,需要进一步研究。表观遗传修饰是银屑病发病的重要机制之一。组蛋白甲基化水平的变化可能与银屑病的发生发展有关,组蛋白甲基化修饰可以对基因进行适当编程,调节银屑病相关分子的产生。赖氨酸甲基转移酶2C(KMT2C)赖氨酸甲基转移酶(KMT2A-D,F和G)家族的成员,通过结合增强子或启动子来调控基因转录。KMT2C参与细胞发育和衰老、DNA损伤反应、内分泌激素治疗敏感性等多种生物学功能的调控。有研究表明KMT2C与一些炎症性疾病,如类风湿性关节炎有关。在银屑病中,KMT2C的表达及生物学作用尚无研究,其调控机制也需深入探索。磷酸肌醇-3-激酶调节亚基3(PIK3R3)编码P55PIK(也称为P55γ,PI3K P85调节亚基的一部分),对细胞增殖和下游炎症信号通路,特别是PI3K/AKT通路至关重要。既往有研究表明,PIK3R3可通过促进IL-6和IL-8的释放并激活AKT通路而加重银屑病。LncRNAs可以通过多种机制调控基因的表达。关于长链非编码RNA(lncRNAs)在银屑病中发挥作用的研究越来越多。本研究分为三部分。第一部分:KMT2C在银屑病中的表达和体外生物学作用研究目的:(1)明确KMT2C在银屑病皮损组织和细胞疾病模型中的表达水平medical education,研究KMT2C对角质形成细胞增殖及银屑病样炎症的影响。(2)预测并验证KMT2C的下游靶基因及调控其表达的具体分子机制。研究方法:(1)收集斑块状银屑病患者皮损和健康对照者正常皮肤组织,通过qRT-PCR和免疫组化验证银屑病皮损区KMT2C的表达。(2)培养人正常角质形成细胞(NHEKs)、人永生化角质形成细胞(HaCaT和Kselleck激酶抑制剂er-CT细胞株),给予M5刺激构建银屑病细胞模型后,采用qRT-PCR和western blot实验检测KMT2C表达水平。(3)转染KMT2C小干扰(siKMT2C),分别采用CCK-8、EDU细胞增殖实验、流式细胞术细胞周期检测、western blot实验和ELISA实验评估角质形成细胞增殖、周期和银屑病相关炎症因子表达水平。(4)在M5刺激的细胞中敲低KMT2C,进行转录组基因测序并分析,通过qRT-PCR实验和western blot实验验证靶基因PIK3R3的表达和相关信号通路的变化。(5)利用CUT&TAG实验检测敲低KMT2C后PIK3R3的启动子和增强子上H3K4me3和H3K4mel的富集水平。研究结果:(1)KMT2C在银屑病皮损中表达显著上调;银屑病角质形成细胞模型中,M5刺激后KMT2C的表达水平较对照组明显升高。(2)敲低KMT2C导致角质形成细胞增殖减少,细胞周期停滞在G1期,细胞周期相关蛋白cyclin D1表达降低,M5诱导的细胞中IL-6、IL-8、CCL20和S100A9水平降低。(3)敲低KMT2C可逆转M5处理角质形成细胞引起的PIK3R3水平升高和下游AKT/NF-κB通路激活。(4)干扰KMT2C的表达可抑制M5诱导的PIK3R3启动子和增强子上H3K4me3和H3K4me1的大量富集。结论:(1)KMT2C表达升高,促进角质形成细胞的增殖以及银屑病相关炎症反应。(2)KMT2C可能通过PIK3R3启动子和增强子靶向调控PIK3R3,从而调节下游AKT/NF-κB通路。第二部分FABP5P3/KMT2C/PIK3R3轴调节细胞增殖和炎症的机制研究研究目的:(1)研究PIK3R3在KMT2C调控银屑病中的作用。(2)检测FABP5P3在银屑病患者皮损组织和银屑病样细胞模型中的表达水平。(3)验证FABP5P3是否靶向调控KMT2C及具体调控机制。研究方法:(1)转染过表达 PIK3R3 质粒(oePIK3R3)、共转染 siKMT2C 与 oePIK3R3后,分别通过CCK-8、细胞周期实验、western blot实验和ELISA实验检测PIK3R3对角质形成细胞增殖、周期和银屑病样炎症反应的影响,通过western blot实验检验AKT/NF-κB信号通路的改变。(2)通过免疫荧光染色和qRT-PCR实验检测FABP5P3在银屑病皮损和银屑病样细胞模型中的表达水平。qRT-PCR和western blot实验检测过表达和敲低FABP5P3 后 KMT2C 的水平。(3)利用生物信息学网站寻找同时与FABP5P3和KMT2C结合的RNA结合蛋白(RBP),免疫荧光染色实验研究FABP5P3与RBP共定位情况,采用免疫共沉淀(RIP)实验验证RBP分别与FABP5P3和KMT2C的直接结合。(4)敲低FABP5P3后,采用RIP实验验证其对RBP与KMT2C的结合的影响,采用放线菌D mRNA稳定性实验检测KMT2C的mRNA降解水平。研究结果:(1)过表达PIK3R3可以逆转siKMT2C引起的角质形成细胞增殖减缓和IL-6、IL-8、CCL20、S100A9水平降低以及AKT/NF-κB信号通路的改变。(2)FABP5P3在银屑病患者皮损区和银屑病样细胞模型中表达上调。(3)RNA结合蛋白HuR可以与FABP5P3和KMT2C结合。敲低FABP5P3导致KMT2C mRNA水平降低、HuR与KMT2C的结合减少。缺乏FABP5P3或HuR显著加快了 KMT2C mRNA的降解。结论:(1)PIK3R3在KMT2C调控AKT/NF-κB信号通路、促进角质形成细胞增殖以及银屑病样炎症的过程中发挥重要作用。(2)在银屑病中,上调的FABP5P3通过招募HuR增加KMT2C mRNA的稳定性。第三部分KMT2C调控银屑病样小鼠表皮增生和皮肤炎症研究目的:明确KMT2C在体内是否参与调selleck Liraglutide控银屑病表皮过度增生和皮肤炎症反应。研究方法:(1)外用咪喹莫特(IMQ)诱导银屑病样小鼠模型,表皮内多点注射siKmt2c,采用改良PASI评分量表评估皮损严重程度;收集皮损组织,制作组织病理切片,HE染色观察表皮增生情况。(2)实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)、western blot、组化染色技术检测KMT2C、PIK3R3和增殖、炎症相关蛋白的表达水平。(3)采用组化染色技术分析KMT2C对Ki-67+细胞数目、对CD3+T细胞及CCR6+细胞趋化的影响。研究结果:(1)外用IMQ成功诱导出银屑病样小鼠模型,敲低KMT2C可减轻银屑病样小鼠模型的表皮增生程度。(2)抑制银屑病样小鼠的表皮中KMT2C的表达可以降低皮损中PIK3R3和炎症相关蛋白IL-6、IL-8、CCL20、S100A9水平。(3)敲低KMT2C可减少IMQ诱导的银屑病小鼠的皮肤中的CD3+T细胞及CCR6+细胞的浸润。结论:下调KMT2C可以改善银屑病小鼠的疾病严重程度。