研究背景恶性肿瘤是当今人类亟待攻克的难题之一,而细胞过继免疫治疗是一种很有前景的肿瘤免疫治疗方法。Th9细胞是以高水平表达白细胞介素(interleukin,IL)-9为特征的新型CD4~+T细胞亚群。近年来,Th9细胞过继免疫治疗在多种肿瘤中表现出较强的抗肿瘤特性,包括黑色素瘤、乳腺癌、肺腺癌以及结肠癌。因此,Th9细胞是肿瘤过继免疫治疗中非常有前途的效应细胞。而探究Th9细胞抗肿瘤的作用机制有助于推进Th9细胞的改造及向临床转化。目前,已有的研究表明,Th9细胞表达的IL-9作为一种T细胞生长因子,有助于促进T细胞增殖和存活;Th9细胞相较于其他效应细胞具有耗竭少,寿命长的特征,这有助于Th9细胞在体内稳定的发挥抗肿瘤功效;Th9细胞衍生的IL-3能够延长树突状细胞(dendritic cells,DCs)INCB28060配制的生存,这有助于诱导肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)反应;Th9细胞分泌颗粒酶(granzyme,Gzm)A和Gzm B,这可能介导Th9细胞的肿瘤细胞毒性。然而,Th9细胞抗肿瘤的关键作用机制尚不明确。基于探寻Th9细胞的关键抗肿瘤机制的目的,我们对Th9细胞进行真核转录组测序及分析,发现Th9细胞除高水平表达特征性细胞因子IL-9以外,还大量表达IL-24。IL-24是IL-10基因家族的一员,已发现有两个异二聚体受体,IL-20R1/IL-20R2和IL-22R1/IL-20R2。IL-24有两种分子形式:细胞内形式和分泌形式。细胞内IL-24能够通过抑制血管生成和肿瘤侵袭、诱导细胞凋亡和自噬、使肿瘤细胞对放疗和化疗敏感等途径在各种类型的肿瘤中发挥抑瘤作用。分泌型IL-24能显著抑制肿瘤细胞的增殖,并诱导肿瘤细胞凋亡。基于以上研究背景,本项研究将探讨IL-24在Th9细胞介导的抗肿瘤活性中的作用,以期为Th9细胞过继免疫治疗挖掘新的关键的效应分子。本研究主要分为以下四个部分:第一部分IL-24在Th9细胞中表达水平的研究目的:探究Th9细胞除特征性表达细胞因子IL-9外,高水平表达的其他细胞因子。方法:(1)从C57BL/6小鼠脾脏分选Na(?)ve CD4~+T细胞,体外诱导生成Th0和Th9细胞,RNA测序技术(RNA sequencing,RNA-seq)测序分析Th9细胞中上调的细胞因子基因表达量;(2)通过实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction,q PCR)、酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和免疫印迹(Western Blot)检测Th9细胞高水平表达的细胞因子的m RNA和蛋白水平;(3)通过q PCR及ELISA检测Th9细胞中该细胞因子不同时间点表达情况;(4)通过q PCR检测该细胞因子在其他T细胞亚型中的表达情况。结果:(1)与Th0细胞相比,Th9细胞高水平表达IL-24;(2)与Th0细胞相比,q PCR、ELISA及Western BlotPhage enzyme-linked immunosorbent assay确认IL-24的m RNA和蛋白水平在Th9细胞中升高;(3)与Th0细胞相比,Th9细胞中IL-24和IL-9的表达呈现出相似的时间模式,且持续高表达;(4)IL-24在Th2和Th9细胞中都表达,但在Th9细胞中表达较高。结论:Th9细胞高水平表达IL-24。第二部分IL-24在Th9细胞分化、增殖及存活中的作用研究目的:探究高水平表达的IL-24在Th9细胞分化、增殖及存活中的作用。方法:(1)从野生型(wildtype,WT)或IL-24基因敲除(IL-24 gene knockout,Il24~(-/-))小鼠脾脏分选Na(?)ve CD4~+T细胞并在体外诱导生成Th9细胞,RNA-seq测序分析敲除IL-24对Th9细胞分化、增殖及存活相关基因表达的差异性;(2)q PCR及ELISA检测各组Th9细胞表达特征性细胞因子IL-9的水平;(3)流式细胞术(Flow Cyto Metry,FCM)检测各组Th9细胞体外增殖及存活的情况;(4)记录体外培养各组Th9细胞的细胞数量;(5)封闭Th9细胞IL-24受体,FCM检测不同组细胞体外增殖及存活的情况;(6)用CFSE标记常规Th9及Il24~(-/-)Th9细胞,过继转移到C57BL/6小鼠体内,FCM检测第5天及第10天不同组细胞体内存活情况。结果:(1)敲除IL-24对Th9相关转录因子如Spi1、Irf4、Stata5、Irf1、Foxo1的表达没有影响,但降低了T细胞增殖和存活有关基因的表达如Ccnd3、Il10、Erdr1;(2)敲除IL-24可使Th9细胞特征性细胞因子IL-9的表达下降;(3)敲除IL-24促进Th9细胞体外增殖,同时也促进Th9细胞体外凋亡;(4)敲除IL-24降低Th9细胞体外培养细胞数量;(5)封闭IL-24受体抑制Th9细胞体外增殖,促进Th9细胞体外凋亡;(6)敲除IL-24会降低Th9细胞在小鼠体内的存活率。结论:IL-24促进Th9细胞存活。第三部分IL-24在Th9细胞抗肿瘤免疫治疗中的作用研究目的:探究IL-24在Th9细胞体内外抗肿瘤中的作用。方法:(1)将WT Th9细胞或Il24~(-/-)Th9细胞通过Transwell与多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)细胞分离共培养,FCM检测肿瘤细胞增殖和凋亡情况;(2)封闭MM细胞表面IL-24受体,将Th9细胞通过Transwell与MM细胞分离共培养,FCM检测不同组细胞体外增殖及存活的情况;(3)C57BL/6小鼠尾静脉注射B16-OVA黑色素瘤细胞后,过继免疫OT-II或OT-II-Il24~(-/-)小鼠来源的Th9细胞,检查肿瘤肺转移情况;(4)C57BL/6小鼠皮下注射B16-OVA细胞,然后过继免疫OT-II或OT-II-Il24~(-/-)小鼠来源的Th9细胞,监测肿瘤生长情况;(5)将CFSE标记的OT-II或OT-II-Il24~(-/-)小鼠来源的Th9细胞经尾静脉过继到C57BL/6小鼠体内,FCM及q PCR检测体内潜在的抗肿瘤因素的变化。结果:(1)基因敲除IL-24可削弱Th9细胞对肿瘤细胞增殖和存活的抑制作用;(2)封闭MM细胞IL-24受体后,Th9细胞体外抗肿瘤效果降低;(3)敲除IL-24可明显减弱Th9细胞诱导的肿瘤肺转移抑制作用;(4)敲除IL-24在很大程度上减弱了Th9细胞对肿瘤生长的抑制作用。(5)OT-II-Il24~(-/-)Th9细胞并未引起小鼠体内CD8~+T细胞比例及Gzm B表达的变化。结论:CP-456773体内实验剂量IL-24促进Th9细胞的抗肿瘤效应。第四部分Foxo1在Th9细胞表达IL-24中的作用研究目的:探究调控Th9细胞表达IL-24的转录因子。方法:(1)再次分析第一部分(1)中所描述的Th0细胞及Th9细胞RNA-seq结果,寻找差异表达的转录因子;(2)q PCR进一步验证这些转录因子在Th9及Il24~(-/-)Th9细胞中的表达水平;(3)在Th9细胞分化的过程中加入Foxo1抑制剂(Foxo1 inhibitor,Foxo1i),q PCR检测IL-9及IL-24表达水平及FCM检测Th9细胞体外增殖存活情况;(4)C57BL/6小鼠尾静脉注射B16-OVA黑色素瘤细胞后,过继免疫OT-II来源的Th9或Foxo1i处理的Th9(Foxo1i-Th9)细胞,检查肿瘤肺转移情况;(5)C57BL/6小鼠皮下注射B16-OVA细胞,然后过继免疫OT-II来源的Th9或Foxo1i-Th9细胞,监测肿瘤生长情况;(6)Foxo1i-Th9细胞过继免疫治疗B16-OVA荷瘤小鼠,同时给予重组IL-24,监测肿瘤生长情况。结果:(1)与Th0细胞相比,Th9细胞有14个转录因子上调,4个转录因子下调;(2)在Th9和Il24~(-/-)Th9细胞中Erg、Npas2、Ahr、Foxo1、Elk3、Stat5b和Runx1的表达增加;(3)Foxo1i处理Th9细胞降低了Th9细胞中Il9和Il24的表达。此外,Foxo1i处理增加了Th9细胞的增殖,但对Th9细胞凋亡没有影响;(4)与常规Th9细胞相比,Foxo1i-Th9细胞增加了小鼠肺部肿瘤负担;(5)与常规Th9细胞相比,Foxo1i-Th9细胞对B16-OVA肿瘤生长的抑制作用较小;(6)重组IL-24的治疗部分恢复了Foxo1i-Th9细胞的抗肿瘤作用。结论:Foxo1调控Th9细胞表达IL-24。