羊的繁殖效率低与卵巢颗粒细胞skin biophysical parameters(Granulosa cells,GC)凋亡引起的卵泡闭锁有关,而卵泡闭锁受到多种生理和环境因素的调节,是一个复杂的生物学过程,调控卵泡闭锁确切的机制仍不清楚。伴侣介导的自噬(Chaperone-mediated autophagy,CMA)对卵泡闭锁及颗粒细胞衰老过程作用日益受到关注。研究表明热休克同源蛋白70(Heat shock cognate protein 70,Hsc70)乙酰化修饰很可能参与分子伴侣自噬的活性,但具体作用机制还有待于研究。本文采用大足黑山羊卵巢颗粒细胞作为研究对象,通过免疫组化、免疫荧光、q RT-PCR、Western Blot、腺病毒转染、免疫沉淀、质谱分析、流式细胞术等方法,探究Hsc70乙酰化介导的分子伴侣自噬对卵巢颗粒细胞功能的影响。得到以下结果:1.H_2O_2对卵巢颗粒细胞分子伴侣自噬的影响提取不同年龄的大足黑山羊卵巢总蛋白和总RNA分别利用Western Blot、q RT-PCR检测不同年龄卵巢中CMA活性。结果发现,衰老卵巢组织中Hsc70 m RNA的相对表达量极显著降低(P<0.01),标志性蛋白Hsc70、LAMP-2A相对表达量均显著下降(P<0.01),底物蛋白GAPDH、MEF2D相对表达量均显著升高(P<0.01)。利用cck-8检测不同浓度和不同时间H_2O_2处理后的卵巢颗粒细胞,发现200μm/L浓度的H_2O_2处理48 h效果最佳。后续进行衰老细胞染色及衰老基因检测,结果显示经过200μm/L浓度处理48 h后细胞衰老数最多,且衰老标志性基因P53和P21的m RNA相对表达量显著上升(P<0.05)。用上述浓度H_2O_2诱导颗粒细胞发生衰老后检测CMA活性,结果显示处理组CMA过程中标志性蛋白LAMP-2A(P<0.01)和Hsc70(P<0.05)相对表达量显著降低,底物蛋白GAPDH(P<0.01)和MEF2D(P<0.05)相对表达量显著下降(P<0.05)。这表明200μm/L的H_2O_2处理后能够显著抑制卵巢颗粒细胞CMA活性。2.去乙酰化酶Sirt2对Hsc70乙酰化的影响利用Trichostatin A(TSA,HDAC家族抑制剂)和Nicotinamide(NAM,Sirtuin家族抑制剂)处理卵巢颗粒细胞后发现NAM对Hsc70乙酰化具有显著促进作用。随后用Sirt2抑制剂的AKG2处理颗粒细胞,发现Hsc70乙酰化增加,表明Hsc70的乙酰化修饰受Sirt2调控。3.Hsc70去乙酰化对分子伴侣自噬的影响质谱分析发现Hsc70在K512位点发生乙酰化修饰。构建高乙酰化和去乙酰化突变体RAD001纯度转染颗粒细胞后,免疫沉淀结果显示当赖氨酸突变为谷氨酰胺后乙酰化升高,当赖氨酸突变为精氨酸后乙酰化降低。分别转染不同突变体后,发现Hsc70去乙酰化组Hsc70和LAMP2A相比Hsc70野生型均显著减少(P<0.01),Hsc70高乙酰化组CMA底物蛋白GAPDH和MEF2D显著减少(P<Lorlatinib小鼠0.01)。综上结果表明Hsc70蛋白在K512位点发生突变,且Hsc70去乙酰化可显著抑制CMA过程。4.Hsc70去乙酰化对卵巢颗粒细胞增殖、凋亡和衰老的影响转染Hsc70及其突变体,发现突变体使增殖相关蛋白PCNA表达量显著降低(P<0.01),颗粒细胞S期减少,Hsc70去乙酰化使G2期增加;Hsc70去乙酰化组Bcl-2/Bax显著下降(P<0.01),Hsc70高乙酰化组Bcl-2/Bax相较于Hsc70野生型没有显著性差异(P>0.05)。流式细胞凋亡分析显示Hsc70去乙酰化可导致卵巢颗粒细胞凋亡增加;双氧水诱导衰老后,过表达Hsc70降低细胞衰老;Hsc70突变体促进细胞衰老。上述结果表明Hsc70去乙酰化抑制卵巢颗粒细胞增殖,促进衰老和凋亡。综合以上结果:(1)衰老卵巢组织中CMA活性低于正常组织;(2)经H_2O_2处理后的颗粒细胞会诱导衰老并抑制CMA过程;(3)Hsc70在赖氨酸第512位点发生乙酰化修饰,去乙酰化酶Sirt2抑制Hsc70乙酰化;(4)Hsc70去乙酰化会抑制卵巢颗粒细胞增殖、促进凋亡和衰老。本文结果为解析Hsc70乙酰化修饰介导的分子伴侣自噬对颗粒细胞的凋亡机制提供了基础。