自然杀伤细胞(Nature Killer Cell,NK)是机体固有免疫的重要组成成分。NK细胞起源于骨髓,经历共同淋巴样祖细胞、NK细胞前体阶段分化发育为NK细胞。经历成熟的NK细胞根据CD11b和CD27或KLRG1的表达分为三needle prostatic biopsy个阶段:CD11b-CD27+、CD11b+CD27+、CD11b+CD27-或 CD11b-KLRG1-、CD11b+KLRG1-、CD11b+KLRG1+。伴随着NK细胞的成熟,其功能逐渐增强。NK细胞杀伤靶细胞无特异性,不需要抗原预先刺激、也不具备MHC限制性,在抗感染和抗肿瘤中发挥重要效应。NK细胞不仅能够释放穿孔素、颗粒酶等和表达FasL、TRAIL等凋亡配体直接诱导靶细胞凋亡,还可以通过分泌细胞因子调节免疫应答反应。然而,受微环境因素的影响,肿瘤浸润NK细胞(Tumor Infiltrating NK cells,TINKs)数目减少、功能障碍,参与肿瘤进程。因此,基于NK细胞的免疫治疗被广泛关注,在抗肿瘤的临床治疗中极具应用前景。深入探讨NK细胞的发育、成熟及生物学功能的调控机制,将有助于进一步改善基于NK细胞免疫治疗的疗效。蛋白质乙酰化通过调控蛋白质的定位、稳定性和功能活性等,参与免疫调节等众多生物学过程。有研究显示,组蛋白去乙酰化酶(Histone Deacetylases,HDACs)抑制剂能够下调NK细胞的存活能力和功能,但HDACs各成员调控NK细胞的作用和机制尚不明确。研究目的1.筛选参与NK细胞稳态和功能调控的潜在HDACs分子2.探索候选HDACs分子调控NK细胞稳态和功能的分子机制研究方法和结果一、HDAC6在活化NK细胞中表达上调1.GSI-IX临床试验HDACs抑制剂下调NK细胞增殖和功能为初步验证HDACs在调控NK细胞稳态和功能中的作用,首先我们选用了两种 HDACs 抑制剂:TSA(Trichostatin A)和 SAHA(Suberoylanilide hydroxamic acid)处理NK-92细胞后,检测NK细胞增殖能力、细胞因子分泌和脱颗粒能力,通过流式细胞术检测发现,抑制剂处理后,NK-92细胞的增殖水平降低,分泌细胞因子和脱颗粒能力下调。以上结果提示,抑制HDACs可以下调NK细胞的增殖水平和效应功能。2.HDAC6在NK细胞活化中显著上调为了初步筛选参与调控NK细胞稳态和功能的HDACs分子,首先利用IL-12和IL-15刺激NK92细胞,检测了 HDACs各成员在mRNA和蛋白水平的表达。结果发现,HDAC6在NK细胞活化过程中表达显著上调。随后,分别以poly(I:C)、NKG2D激动性抗体刺激NK92细胞,检测不同时间点HDAC6表达,结果显示HDAC6在mRNA和蛋白水平均呈时间依赖性升高。上述结果提示,HDAC6可能参与调控NK细胞的活化和功能。二、HDAC6参与维持NK细胞稳态和功能1.Hdac6基因缺失下调NK细胞的比例和数目繁育Hdac6基因敲除(Hdac6 KO)小鼠,流式细胞术检测小鼠肝脏、脾脏和外周血中NK细胞的比例和数目,结果发现,与野生型小鼠(WT)相比,NK细胞的比例和数目均下调。进一步检测骨髓NK细胞前体,共同淋巴样祖细胞(CLP)前NK细胞前体(pre-NKP)和重定义NK细胞前体(rNKP),结果发现WT小鼠和Hdac6KO小鼠间NK细胞前体无明显差异。骨髓共回输实验显示,受体鼠脾脏中Hdac6KO NK细胞的比例低于WT小鼠NK细胞。上述结果显示,HDAC6内源性调控NK细胞稳态。2.HDAC6表达促进NK细胞增殖为明确HDAC6调控NK细胞稳态的机制,比较Hdac6KO NK细胞和WT NK细胞的增殖和凋亡水平,结果发现Hdac6基因敲除抑制NK细胞的增殖,并不影响NK细胞的凋亡。在NK92细胞中过表达和小干扰HDAC6进一步验证了上述结果。3.Hdac6基因缺失抑制NK细胞成熟NK细胞的免疫效应取决于其数量和成熟状态,因此课题进一步检测了Hdac6对NK细胞成熟的影响。流式细胞术检测了肝脏和脾脏NK细胞中CD27、CD11b或KLRG1的表达情况,结果显示Hdac6基因敲除抑制NK细胞成熟。同时,与WT小鼠NK细胞相比,Hdac6 KO小鼠NK细胞表达成熟标记T-bet和Eomes的比例显著下调。骨髓共回输实验,发现受体鼠脾脏中Hdac6 KO NK细胞KLRG1的表达低于的WTNK细胞。上述结果表明,HDAC6内源性调控NK细胞的成熟。4.HDAC6表达能够增强NK细胞功能NK细胞经历成熟后最终获得功能的优化。课题进一步检测了 HDAC6对NK功能的调控作用。分别以IL-12和IL-15刺激纯化的小鼠脾脏NK细胞,或以靶细胞Yac-1刺激骨髓、脾脏和外周血单个核细胞,流式细胞术检测NK细胞杀伤能力和细胞因子产生能力。结果显示,与WT小鼠NK细胞相比,Hdac6 KO NK细胞分泌细胞因子的能力降低,对Yac-1细胞的杀伤能力明显下调。骨髓共回输实验,发现受体鼠脾脏中Hdac6 KO NK细胞的细胞因子表达显著低于WT NK细胞。在NK92中过表达或者小干扰HDAC6进一步验证了上述结果。上述结果表明,HDAC6内源性增强NK细胞功能。三、HDAC6介导HSP90去乙酰化、增强STAT5的磷酸化和NK细胞功能1.IL-15/STAT5信号通路参与HDAC6表达对NK细胞功能的影响IL-15信号通路在NK细胞增殖、成熟和功能调控中发挥重要作用。因此,本论文进一步探讨了 HDAC6对NK细胞中IL-15信号通路的影响。首先,分别以20 ng/ml和50 ng/ml的IL-15刺激NK细胞,结果表明,与WTNK细胞相比,Hdac6 KO NK细胞分泌CD107a和IFN-γ的能力显著下调,但IL-15受体CD122和CD132的表达无明显差异。Hdac6基因敲除下调NK细胞中STAT5磷酸化水平,且STAT5抑制剂能够消除Hdac6基因缺失或过表达对NK细胞的影响。上述结果提示,HDAC6可能通过调控IL-15信号通路进而影响NK细胞功能。2.HDAC6介导NK细胞中HSP90蛋白的去乙酰化、上调STAT5磷酸化水平和NK细胞功能已有文献报道,磷酸化STAT5是HSP90的客户分子,而HSP90是HDAC6的去乙酰化底物蛋白,Hdac6基因缺失会导致HSP90超乙酰化,丧失其伴侣活性。免疫共沉淀实验显示,与对照细胞相比,IL-15刺激NK-92细胞中HSP90乙酰化水平下调,HSP90与磷酸化STAT5的结合增强,且HSP90抑制剂17-AAG显著下调IL-15刺激NK92细胞中STAT5磷酸化水平和细胞因子的分泌。更为重要地,干扰HDAC6表达导致NK-92细胞中HSP90乙酰化上调,HSP90与磷酸化的STAT5相互作用减弱,而过表达HDAC6则发挥相反的作用。同时,17-AAG能够消除HDAC6过表达对NK细胞功能的影响。以上结果证明HDAC6通过调控HSP90的乙酰化、促进STAT5信号通路和NK细胞功能。研究结论1.HD AC6在NK细胞活化中表达上调。2.Hdac6敲除小鼠NK细胞比例下调、成熟、selleck抑制剂增殖及功能受到抑制。3.HDAC6通过介导HSP90去乙酰化、增强HSP90与磷酸化STAT5结合,进而促进STAT5信号通路活化和NK细胞的增殖及功能成熟。创新性及意义1.本研究发现了 HDAC6在NK细胞活化过程中表达上调,且能够调控NK细胞的稳态、成熟和功能,为增强NK细胞抗肿瘤治疗提供了可能的靶点。2.课题初步证实HDAC6通过调控HSP90/STAT5信号通路促进NK细胞成熟及功能,为阐明NK细胞的调控机制提供了新的依据。