目的:探索在体内、外肾间质纤维化模型中,MSCs经半乳糖凝集素-3(Galectin-3,Gal-3)基因调控自噬抗纤维化的可能机制。方法:体外实验:以人源重组TGF-β1(10 ng/m L)细胞因子处理正常人肾小管上皮细胞(HK-2)48 h,建立体外肾间质纤维化模型。实验分为7组,正常组、TGF-β1组、TGF-β1+MSCs条件培养基(MSCs Conditional Medium,MSCs-CM)组、TGF-β1+MSCs-CM+3-MA(自噬抑制剂,2 m M)组、TGF-β1+MSCs-CM+MG-132(自噬激动剂,100 n M)组、TGF-β1+3-MA组和TGF-β1+MG-132组。MSCs-CM、3-MA和MG-132均干预48 h后,western blot检测Gal-3/ULK1(Unc-51-like kinase 1)/TRIM16(The E3 ligase tripartite motif 16)复合BLZ945体内实验剂量体、自噬、EMT(Epithelial-Mesenchymal Transition)及ECM(Extracellular matrix)的表达水平。为进一步探究在MSCs抗肾间质纤维化过程中,Gal-3基因调控对自噬和纤维化的影响,利用慢病毒载体构建人Gal-3敲低和过表达载体,分别建立Gal-3 KD和Gal-3 OE的HK-2工具细胞。分组同前,western Colforsin采购blot检测上述指标,空载病毒作为对照。为检测Gal-3表达与ULK1和TRIM16之间的互作关系,Co IP技术检测Gal-3与ULK1和TRIM16蛋白在TGF-β1诱导及MSCs干预后的结合情况。体内实验,雄性SD大鼠40只(220±20 g),用含4.5%浓度腺嘌呤(Adenine)的生理盐水混悬液按照150 mg/kg/d标准连续灌胃15天建立肾间质纤维化模型。根据随机数字表将大鼠随机分为5组,分别是正常组、Adenine组、Adenine+MSCs组、Adenine+柑橘果胶(Modified citrus pectin,MCP,Gal-3抑制剂)组、Adenine+MSCs+MCP组,建模的同时以0.1%浓度的MCP溶于饮用水给药,用量为100mg/kg/d,持续至取材前一天。建模结束后,尾静脉注射生理盐水MSCs(P3)细胞悬液(2×10oncologic outcome~6个/kg)。收集血清检测肌酐、尿素氮评定肾脏功能;收集各组肾脏组织常规石蜡包埋切片后HE、Masson和Sirius Red染色检测病理状态;Western Blot检测肾脏组织Gal-3/ULK1/TRIM16复合物、自噬、EMT及ECM的表达变化。结果:1.在正常HK-2细胞中,用10 ng/m L TGF-β1处理48 h后,较正常组明显增加FN、COL1、α-SMA、ATG5、ATG7、LC3BⅡ/Ⅰ比值、Gal-3、ULK1和TRIM16蛋白表达,同时降低EMT标志物E-cadherin以及自噬标志物p62表达(P<0.05)。与TGF-β1组相比较,经MSCs-CM、3-MA或MSCs-CM+3-MA干预后,上述指标呈现相反趋势(P<0.05),且MSCs-CM+3-MA较3-MA或MSCs-CM干预趋势更为显著(P<0.05)。2.正常HK-2细胞,KD-con空载细胞和OE-con空载细胞之间,EMT和自噬核心指标α-SMA、E-cadherin、p62和LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表达三组间均无显著统计学差异。3.在Gal-3 KD和Gal-3 OE HK-2细胞的分组中,均与正常HK-2分组中呈现相同趋势,TGF-β1处理后均较对照组明显增加FN、COL1、α-SMA、ATG5、ATG7、LC3BⅡ/Ⅰ比值、Gal-3、ULK1和TRIM16蛋白表达,同时EMT标志物E-cadherin以及自噬标志物p62显著降低(P<0.05);在MSCs-CM干预后,呈相反趋势(P<0.05),且MSCs+3-MA组较MSCs-CM组FN、COL1、α-SMA、ATG5、ATG7、LC3BⅡ/Ⅰ比值、Gal-3、ULK1和TRIM16蛋白表达显著降低(P<0.05),同时EMT标志物E-cadherin以及自噬标志物p62显著增高(P<0.05);Gal-3 KD组与Gal-3OE组相同亚组之间对比,Gal-3 KD各亚组中FN、COL1、α-SMA、ATG5、ATG7、LC3BⅡ/Ⅰ比值、Gal-3、ULK1、TRIM16蛋白表达较Gal-3 OE各亚组明显降低,同时EMT标志物E-cadherin以及自噬标志物p62显著增高(P<0.05)。4.利用Gal-3抗体将与其结合的蛋白沉淀,结果显示TGF-β1相较于正常组,TRIM16和ULK1的表达增加(P<0.05);与TGF-β1组比较,MSCs-CM干预后,与Gal-3结合的ULK1和TRIM16含量减少(P<0.05)。5.在Adenine诱导建立肾纤维化模型后,HE、Masson、Sirius Red结果显示,Adenine组肾小管囊性扩张,炎性细胞浸润、肾脏损伤评分增大,肾间质细胞外基质成分胶原纤维增多(P<0.05)。而MSCs、MCP及其二者共同作用后,三个治疗组的大鼠肾脏损伤评分降低、肾小管间质中细胞外基质胶原成分降低(P<0.05),且MSCs与MCP联用后Sirius Red显示胶原纤维降低更显著(P<0.05)。6.肾脏组织Western Blot结果显示,Adenine组大鼠肾脏组织中FN、COL1、α-SMA、ATG5、ATG7、LC3BⅡ/Ⅰ比值、Gal-3、ULK1和TRIM16较正常组大鼠肾脏组织上述蛋白表达明显增加,同时E-cadherin和p62蛋白表达显著降低(P<0.05),而经MSCs、MCP和MSCs+MCP治疗后,大鼠肾脏组织中上述蛋白表达较模型组大鼠呈相反趋势(P<0.05),且Adenine+MSCs+MCP组较Adenine+MSCs组与Adenine+MCP组的肾脏组织FN、COL1、α-SMA、ATG5、ATG7、LC3BⅡ/Ⅰ比值、Gal-3、ULK1和TRIM16较Adenine组蛋白表达明显增加,同时E-cadherin和p62蛋白表达显著降低(P<0.05)结论:MSCs在体内、外实验肾间质纤维化模型中均显示较好的抗纤作用,其机制可能通过下调Gal-3/ULK1/TRIM16复合体的表达抑制自噬、抑制EMT而改善肾纤维化。