目的:线粒体功能障碍导致的多巴胺能神经元丢失是广泛接受的帕金森病(Parkinson’s disease,PD)发Organizational Aspects of Cell Biology病机制之一。线粒体动力学是指线粒体通过不断进行分裂和融合,维持线粒体稳态,为细胞提供能量,调节细胞自噬和凋亡的过程。线粒体动力学异常,可导致线粒体功能障碍,与多巴胺能神经元的存活密切相关,可能是线粒体介导PD发病的机制之一。Fbxw7是一种进化保守的F-box蛋白,目前已被广泛认为是一种经典的肿瘤抑制因子。越来越多的证据表明,Fbxw7可以通过调控细胞周期、细胞生长和存活,参与神经退行性变的病理过程,但是Fbxw7在PD中的具体作用及其参与PD的发病机制仍不清楚。另有研究表明Fbxw7能够与STAT3结合影响STAT3的表达和泛素化降解,通过STAT3调控线粒体动力学相关蛋白的表达。基于以上研究背景,本研究将利用PD动物和细胞模型,探讨Fbxw7是否能够通过介导STAT3的活化调控线粒体分裂/融合进而影响PD病理进程,以期阐明Fbxw7在PD发病机制中的可能作用。方法:1.MPTP构建小鼠PD模型。20只雄性C57BL/6J小鼠随机分两组(每组10只):正常对照组(CON组)和疾病组(MPTP组)。转棒实验、爬杆实验评估小鼠的运动能力。行为学实验证实造模成功后,各组小鼠取中脑,采用Western Blotting技术检测Fbxw7、p-STAT3、线粒体分裂相关蛋白(Drp1)、线粒体融合相关蛋白(Mfn2、OPA1)在两组中蛋白表达水平的变化。2.选用不同浓度(100μmol/L、200μmol/L、400selleck NMRμmol/L、800μmol/L、1200μmol/L、1600μmol/L、1800μmol/L)的MPP~+处理MN9D细胞,CCK8测定细胞活力,选择最适浓度构建PD细胞模型。3.建立稳定表达Fbxw7的MN9D细胞。根据实验2中摸索的MPP~+药物浓度处理细胞,实验分为四组:对照组(CON组)、疾病组(MPP~+组)、疾病+转染空载体组(MPP~++NC组)、疾病+转染过表达Fbxw7质粒组(MPP~++OE组),采用q PCR技术、Western Blotting技术验证转染效率。4.利用DCFH-DA探针检测四组MN9D细胞中ROS的水平,JC-1荧光探针检测四组MN9D细胞中线粒体膜电位的水平。Western Blotting技术观察四组中p-STAT3蛋白和DRP1、OPA1、Mfn2蛋白表达水平的变化。结果:1.与CON组相比,MPTP组小鼠爬杆实验时间明显延长(P<0.05),转棒实验时间明显缩短(P<0.05),MPTP组小鼠存在运动功能障碍,成功构建急性小鼠PD损伤模型。2.与CON组相比,MPTP组小鼠中脑中的Fbxw7蛋白表达明显降低(P<0.05),p-STAT3蛋白表达明显升高(P<0.05);DRP1蛋白表达明显增加(P<0.05),OPA1、Mfn2蛋白表达明显减少(P<0.05),Fbxw7蛋白、p-STAT3蛋白、线粒体动力学相关蛋白表达水平的变化可能与PD相关。3.MPP~+对MN9D细胞的损伤力随着其药物浓度的升高而增加,本实验选取1600μmol/L MPP~+处理后续实验MN9D细胞,此浓度下细胞存活率为72%(P<0.05)。4.与CON组相比,MPP~+组MN9D细胞中的Fbxw7 m RNA和蛋白的表达明显降低(P<0.05),与动物结果一致;与MPP~++NC组相比,MPP~++OE组Fbxw7 m RNA和蛋白的表达明显升高(P<0.05),表明过表达Fbxw7质粒转染成功。5.与CON组相比,MPP~+组MN9D细胞中的DCF荧光强度明显增强(P<0.05);与MPP~++NC组相比,MPP~++OE组MN9D细胞中DCF荧光强度明显减弱,ROS水平明显降低(P<0.05),表明Fbxw7降低了由MPP~+引起的ROS增加。6.与CON组相比,MPP~+组MN9D细胞中的红色荧光减弱,绿色荧光增强,线粒体膜电位明显降低(P<0.05);与MPP~++NC组相比,MPP~++OE组MN9D细胞中红色荧光增强,绿色荧光减弱,线粒体膜电位明显升高(P<0.05),表明过表达Fbxw7升高了由MPP~+导致的线粒体膜电位下降。7.与CON组相比,MPP~+组MN9D细胞中的p-STAT3蛋白的表达明显增加(P<0.05);与MPP~++NC组相比,MPP~++OE组MN9D细胞中p-STAT3蛋白的表达明显降低(P<0.05),表明过表达FbCell Cycle抑制剂xw7降低了由MPP~+引起的p-STAT3蛋白升高。8.与CON组相比,MPP~+组MN9D细胞中的DRP1蛋白表达明显升高(P<0.05),OPA1蛋白和Mfn2蛋白表达明显降低(P<0.05);与MPP~++NC组相比,MPP~++OE组MN9D细胞中DRP1蛋白表达明显降低(P<0.05),OPA1蛋白和Mfn2蛋白表达明显升高(P<0.05),表明过表达Fbxw7恢复了MPP~+导致的线粒体动力学相关蛋白表达异常。结论:1.Fbxw7在PD中发挥保护作用;2.Fbxw7可以调控PD中的线粒体动力学;3.Fbxw7可能通过调节STAT3的活化,调控线粒体动力学,进而在PD中发挥保护作用。