背景和目的胰腺癌是恶性程度极高的消化系统肿瘤,具有早期临床症状不典型、容易发生购买Ferrostatin-1转移、化疗易耐药和靶向与免疫治疗不敏感等特点,其患者的五年总体生存率仅为12%。因此,亟需进一步探索胰腺癌容易发生侵袭转移的分子机制,进而寻找新型的治疗靶点。Entosis,即细胞套亡,是由cell-in-cell(CIC)结构形成介导的一种非凋亡性的程序性细胞死亡方式,已被证实与包括胰腺癌在内的多种恶性肿瘤的进展有关。但是,Entosis在胰腺癌进展中发挥的具体作用与机制目前尚不清楚。本研究旨在:(1)探索胰腺癌组织和细胞系中是否存在Entosis现象,并研究其与胰腺癌进展的相关性;(2)筛选并验证胰腺癌发生Entosis的关键调控分子,并探究其在胰腺癌进展的作用;(3)探讨Entosis现象及其关键调控分子是否为推动胰腺癌进展的危险因素。方法通过分析公共数据库中胰腺癌的测序数据和临床信息,探讨程序性细胞死亡的关键调控分子在胰腺癌和正常胰腺组织中的差异表达水平,及其与患者预后的相关性。通过悬浮培养的方式诱导胰腺癌细胞间形成CIC结构,利用细胞免疫荧光和透射电镜扫描观察CIC结构的形态特征,并利用活细胞延时显微成像观察内Hydro-biogeochemical model化细胞的命运结局。接下来,利用慢病毒载体构建敲低或过表达的稳转细胞株,并通过流式细胞荧光分选技术富集正在经历CIC形成过程的细胞群;利用单细胞转录组测序探索形成CIC结构后细胞亚群的基因表达特征。此外,在体外通过CCK-8细胞增殖实验、Transwell实验、失巢凋亡诱导实验和细胞竞争实验检测细胞增殖、迁移、侵袭、抵抗失巢凋亡和细胞间直接竞争的能力,并用实时荧光定量PCR和Western blot实验检测目的基因的RNA和蛋白表达水平。通过免疫组织化学染色和生存分析评估目的基因的表达水平与胰腺癌患者预后的相关性,并在裸鼠皮下移植瘤模型和胰腺原位移植瘤模型中比较肿瘤细胞在体内的成瘤和转移能力。结果对Vorinostat体外公共数据库中不同类型程序性细胞死亡相关通路代表性基因的转录组测序结果分析显示:在众多程序性细胞死亡通路中,Entosis通路的基因在癌与正常组织中的表达差异最为显著—相关基因在胰腺癌组织中普遍表达上调,并且与患者的预后不良有关;并且,与其他恶性肿瘤相比而言,这一通路的基因表达差异在胰腺癌中最为显著。对胰腺癌组织样本中CIC结构的统计结果提示,CIC现象与患者的预后不良有关,并且在胰腺癌肝转移灶中较原发灶更为多见,由此推测这可能代表了一种侵袭性的病理特征。通过单细胞转录组测序分析发现了数个具有促癌作用的基因在经历了 CIC过程后的细胞亚群中表达上调,如NET1,ALDH3A1,PLAT,GALNT5,和FAM3C。随后的细胞功能实验结果表明,形成CIC结构的这群细胞具有更强的细胞增殖、迁移侵袭和失巢凋亡抵抗的能力;动物实验的结果同时显示,这群细胞的体内成瘤和转移能力更强。功能实验的结果提示,NET1是Entosis的重要调控基因,该基因的过表达能够促进胰腺癌细胞间形成CIC结构,且NET1高表达的胰腺癌细胞表现出更强的恶性生物学特性。最后,临床队列的结果表明,NET1在蛋白水平的高表达与胰腺癌患者更差的预后显著相关,可能是促进胰腺癌进展的危险因素。结论本研究首次报道,胰腺癌细胞利用Entosis产生了一群具有更强“转移性”的细胞亚群,这可能是导致胰腺癌预后较差的原因之一。本研究通过一系列细胞功能实验和动物实验首次确认NET1是Entosis的重要调控分子,可能在胰腺癌进展中起促进作用。靶向Entosis通路的关键分子有望成为胰腺癌的新型治疗选择。