【目的】真核翻译起始因子5A2(eukaryotic translation initiation factor 5A2,EIF5A2)是近年来新发现的候选癌基因,目前肝内胆管癌中EIF5A2的表达和具体生物学作用不清,本研究旨在明确肝内胆管癌肿瘤组织中EIF5A2的表达情况,探讨EIF5A2表达与肝内胆管癌临床病理学特征及预后的相关性,研究EIF5A2促进肝内胆管癌进展的分子机理,从而深入揭露肝内胆管癌的发病机制。【方法】收集临床石蜡组织标本,其中包括肝内胆管癌组织191例(组织芯片141例,临床样本50例)、正常肝组织32例,12例肝内胆管组织,通过免疫组化(IHC)检测肝内胆管癌癌组织、癌旁组织、正常肝组织和肝内胆管组织中EIF5A2的表达差异,采用Western Blot法检测8例配对的肝内胆管癌肿瘤组织和癌旁组织中EIF5A2的BAY 73-4506浓度表达;依据免疫组化半定量评分法对免疫组化结果进行评分,结合组织芯片的临床病理资料,对126例含完整随访数据病例资料进行分析,探讨EIF5A2与肝内胆管癌临床病理特征之间的关系及对肝内胆管癌患者总生存率和累积复发率的影响。QPCR和Western Blot检测HIBEpi C、RBE、HCCC9810和HUCCT1细胞中EIF5A2 m RNA和蛋白的表达水平,细胞免疫荧光(IF)观察EIF5A2在细胞中的定位,选择HCCC9810细胞株稳定转染敲低EIF5A2基因的表达,在HUCCT1细胞株中稳定转染过表达EIF5A2,CCK-8实验和Ed U细胞增殖实验评估细胞增殖能力,流式细胞仪检测敲低和过表达EIF5A2后ICC细胞株细胞周期的变化,划痕实验与Transwell迁移侵袭实验观察肿瘤细胞的迁移侵袭能力的改变。选择敲低EIF5A2的稳转株HCCC9810-sh RNA1和HCCC9810-sh NC(阴性对照)进行转录组测序分析(RNA-seq),差异基因进行GO分析与KEGG富集分析,探索EIF5A2在肝内胆管癌发生发展过程中的潜在生物学功能以及可能参与调控的信号通路,免疫共沉淀(Co-IP)研究EIF5A2蛋白和MTA1蛋白之间是否有相互作用关系;瞬时转染si RNA对HUCCT1-EIF5A2细胞中EIF5A2下游蛋白MTA1进行敲低,检测敲低MTA1后对细胞增殖、侵袭迁移、PI3K/AKT/mTOR信号通路及Cyclin D1、Cyclin D3和MMP2、MMP9的影响;PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂LY294002处理HUCCT1-EIF5A2细胞,检测PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制前后对细胞增殖、侵袭迁移及相应蛋白分子表达的影响;Western Blot检测EIF5A2对肝内胆管癌细胞上皮间质转化(EMT)的影响。在裸鼠动物模型中,选择稳定转染细胞株HCCC9810-sh NC、HCCC9810-sh RNA1、HUCCT1-Vector、HUCCT1-EIF5A2建立皮下成瘤模型,记录并分析裸鼠皮下瘤体的体积和重量,Western Blot检测裸鼠皮下成瘤后瘤块组织中EIF5A2、MTA1、Cyclin D1、Cyclin D3和MMP2、MMP9蛋白的表达量。【结果】免疫组化结果显示,EIF5A2主要在肿瘤细胞的细胞质和细胞核中表达,191例肝内胆管癌中EIF5A2高表达98例(51.3%),正常肝组织中EIF5A2高表达6例(18.8%),肝内胆管组织中EIF5A2高表达1例(8.3%);对组织芯片中141例石蜡组织标本(含癌组织、癌旁组织)进行免疫组化染色,癌组织高表达62例(44.0%),癌旁组织高表达35例(24.8%),癌组织中EIF5A2的表达高于癌旁组织、正常肝组织和肝内胆管组织;8对新鲜癌组织、癌旁组织提取总蛋白后进行Western Blot检测,结果显示癌组织中EIF5A2的表达高于癌旁组织(P<0.05)。EIF5A2与肝内胆管癌临床病理分析结果显示,EIF5A2的表达升高与微血管/胆管侵犯(P=0.044)、肿瘤分化(P=0.014)、淋巴转移(P=0.033)、TNM分期(P=0.002)显著相关,与年龄、性别、肝硬化、ALT、Child-Pugh分级、CA19-9、肿瘤直径、肿瘤数目无明显相关性;单因素分析显示EIF5A2表达升高是总生存率低和累积复发率高的高危因素,多因素分析显示EIF5A2是预测肝内胆管癌患者预后的独立危险因素。CCK8和Ed U细胞增殖实验显示,敲低EIF5A2后HCCC9810-sh RNA1组与HCCC9810-sh NC组比较,增殖能力明显受到抑Biofuel combustion制,在HUCCT1细胞中过表达EIF5A2后细胞增殖能力增强;流式细胞仪细胞周期检测显示EIF5A2有助于肝内胆管癌细胞跨越G0/G1期进而促进肿瘤细胞增殖;划痕实验与Transwell迁移侵袭实验显示EIF5A2的过表达增强了肝内胆管癌细胞的迁移和侵袭能力。RNA-seq分析发现敲低EIF5A2后差异基因GO富集于细胞迁移、细胞分化、生长因子激活、转录因子与DNA的结合等功能,KEGG富集于Wnt、VEGF、PI3K/AKT、mTOR和IL-17等信号通路;细胞表型实验发现EIF5A2可明显促进肝内胆管癌细胞的增殖和迁移侵袭,结合GO分析的结果,Western Blot验证了7个受EIF5A2影响且与增殖侵袭转移密切相关蛋白,发现在肝内胆管癌中EIF5A2通过转录调控MTA1的表达,Co-IP结果显示EIF5A2和MTA1两个蛋白之间无相互作用关系,此外EIF5A2依赖MTA1激活PI3K/AKT/mTOR信号通路进而影响癌细胞增殖和迁移侵袭,在HUCCT1-EIF5A2细胞中敲低MTA1后细胞增殖、侵袭迁移被抑制,p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、Cyclin D1、Cyclin D3和MMP2、MMP9表达下降,HUCCT1-EIF5A2细胞中抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路后,EIF5A2促进HUCCT1细胞增殖、侵袭转移的能力明显被抑制,相应蛋白分子表达水平下降;此外,Western Blot检测结果证实EIF5A2通过上调转录因子Snail2和Twist1调控肝内胆管癌细胞的上皮间充质转化(EMT),但对转录因子Snail的表达无明显影响。裸鼠皮下成瘤结果显示,沉默EIF5A2的裸鼠皮下瘤体体积更小、质量更轻,过表达EIF5A2促进了裸鼠皮下瘤的生长;Western Blot实验检测裸鼠皮下瘤块组织中蛋白的表达差异,在体内验证了EIF5A2调控MTA1的表达,并影响Cyclin D1、Cyclin D3、MMP2、MMP9的蛋白表达水平。【结论】EIF5A2在肝内胆管癌组织中高表达,与微血管/胆管侵犯、肿瘤分化、淋巴转移、TNM分期密切相关,高表达EIF5A2的患者总生存率低、累计复发率高,是肝内胆管癌患者预后的独立危险因素。EIF5A2在肝内胆管癌细胞株中的表达高于人肝内胆管上皮细胞,在肝内胆管癌细胞株HCCC9810中EIF5A2表达最高,在RBE、HUCCT1细胞中表达低,主要定位表达在细胞质与细胞核中;高表达的EIF5A2可促使肝内胆管癌细胞跨越G0/G1期进而促进增殖,同时增强了肝内胆管癌细胞的迁移侵袭能力。EIF5A2转录调控MTA1的表达激活PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导Cyclin D1、Cyclin D3、MMP2和MMP9的上调,进而促进肝内胆管癌细胞增殖和侵袭转移,EIF5A2还通过上调转录因子S获悉更多nail2和Twist1调节肝内胆管癌细胞的上皮间充质转化(EMT),但对转录因子Snail的表达无明显影响。高表达的EIF5A2可促进裸鼠皮下瘤块的生长,增加皮下瘤块中MMP2、MMP9的表达,增强肝内胆管癌侵袭转移能力。