研究背景心血管疾病仍然是世界范围内的主要死亡原因,血管损伤引起的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)过度增殖和迁移,在冠心病、血管成形术后再狭窄以及肺动脉高压等多种心血管疾病的发病机制中发挥关键作用。VSMCs位于血管壁的中间层,是高度特化的细胞,负责调节血管张力,进而调节血液分布和压力。与大多数终末分化细胞不同,在生长因子、细胞因子、机械力以及其他损伤刺激下,VSMC可以在收缩(分化)表型和合成(去分化)表型之间转化,即VSMCs的表型转化(phenotypic switch)。其中,血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)-BB主要由损伤部位的血管内皮细胞和血小板释放,能够调节多种转录因子和信号通路,促进损伤后VSMC增殖并向新生内膜层迁移,是目前研究最有效的VSMC表型转化刺激剂之一。然而,PDGF-BB作为VSMC表型开关的分子机制尚不明确。环状RNAs(circular RNAs,circ RNAs)是一类具有基因调控作用的非编码RNA,与传统线性RNA相比,circ RNA由外显子或内含子首尾相接而成,呈独特的封闭环状结构,耐受核酸外切酶降解,具有较长的半衰期。越来越多的证据表明circ RNAs在发育、衰老、癌症等生理病理过程中发挥重要的调控作用。既往报道的circ RNAs可作为微小RNAs(mi RNAs)分子海绵调控下游靶基因的表达,还可发挥蛋白支架、转录调控、竞争线性剪接以及多肽翻译等多种功能。近年来,circ RNAs在心血管疾病中的研究进展迅速,例如circ MAP3K5通过调节mi R-22-3p/TET2通路影响PDGFBB介导的平滑肌细胞分化;circ ITCH能够海绵mi R-330-5p并上调SIRT6、Survivin和SERCA2a表达,改善阿霉素诱导的心脏毒性。但目前为止,针对VSMC表型转化的circ RNA研究相对较少,且大多数circ RNAs都被认为是细胞质中的mi RNAs海绵,对于circ RNAs在转录后调控的作用尚不明确。因此,探索新的VSMC表型转化相关circ RNAs,全面揭示其下游调控机制,对动脉粥样硬化、肺高压等血管增殖性疾病具有重要的诊断和治疗价值。本课题中,我们利用高通量RNA测序对PDGF-BB刺激的人主动脉平滑肌细胞(human aortic smooth muscle cells,Ao SMCs)中差异表达的circ RNAs进行筛选,通过生物信息学分析及表达验证鉴定差异显著、序列保守的circ RNAs,并对其调控Ao SMC增殖、迁移以及表型转化的功能及机制进行深入研究。第一部分:环状RNA circ SATB2＿015的筛选和鉴定方法:1)建立PDGF-BB刺激的Ao SMC表型转化模型,进行去线性、去核糖体RNA(r RNA)的高通量测序,结合生物信息学筛选差异表达的circ RNAs,并对差异circ RNAs进行富集分析;2)通过q RT-PCR实验,对候选circ RNAs在PDGFBB、10%FBS诱导增殖模型以及SMDM分化模型中的表达进行验证;3)通过c DNA/g DNA实验、Sanger测序、放线菌素D实验以及RNase R消化实验,对目标circ RNA进行成环性验证;4)通过数据库检索(circ Base、circ Bank、UCSC)分析目标circ RNA的基因信息、保守性及翻译潜能;通过q RT-PCR明确目标circ RNA的表达丰度;5)通过核质RNA分提、RNA荧光原位杂交实验(FISH)明确目标circ RNA的胞内核质分布情况;6)通过HE染色、RNA荧光原位杂交(FISH)及免疫荧光(IF)实验,明确目标circ RNA在人冠心病血管组织中的表达情况。结果:1)通过高通量测序筛选,以P<0.05为过滤条件、Fold change=1.5为筛选标准,得到71条PDGF-BB刺激差异表达的circ RNAs(上调:40条,下调:31条),对差异circ RNAs进行聚类分析、保守性评估、宿主基因GO富集分析、KEGG以及Reactome信号通路分析筛选得到12条候选circ RNAs;2)QRT-PCR验证显示,相比其他候选circ RNAs,hsa＿circ＿0003915(hsa＿circ SATB2＿015)在PDGF-BB刺激模型中下调最为明显且重复性好,PDGF-BB、10%FBS均可引GSK2118436体内起hsa＿circ＿0003915的时间依赖性下调,而SMDM分化培养可引起hsa＿circ＿0003915时间依赖性上调;3)跨接头序列的反向引物(背靠背)在c DNA中扩增得到DNA片段,而在g DNA未检测到扩增产物,对扩增片段进行Sanger测序测到hsa＿circ＿0003915的接头序列,放线菌素D(actinomycin D)实验及RNase R消化实验显示hsa＿circ＿0003915相比线性RNA具备更长半衰期、能够耐受核酸外切酶的降解;4)Hsa＿circ＿0003915与mmu＿circ＿008822在序列上高度保守(93%),且存在开放阅读框(ORF)和内部核糖体进入位点(IRES)序列,hsa＿circ＿0003915在Ao SMC、HUVEC、PASMC等脉管细胞中显著高表达;5)核质RNA分提及RNA-FISH实验证明hsa＿circ＿0003915主要定位于胞浆(胞浆84.1%,胞核15.9%);6)组织样本RNA-FISH实验表明,hsa＿circ＿0003915(circ SATB2＿015)在冠心病患者冠脉组织中低表达。结论:通过对PDGF-BB刺激的Ao SMC表型转化模型进行去线性、去r RNA的高通量测序,结合生物信息学、细胞模型表达验证、成环性验证及分子特征鉴定,筛选得到一条在PDGF-BB刺激细胞模型、动脉粥样硬化血管组织中显著下调的circ RNA,命名为circ SATB2＿015,该circ RNA由2q33.1染色体上SATB2基因(NM＿001172509.2)的4-7外显子环状剪接而成,全长为531bp,胞浆富集,序列在人和小鼠中高度保守。第二部分:Circ SATB2＿015调节血管平滑肌细胞增殖、迁移及分化,改善内膜增生方法:1)设计合成circ SATB2＿015的si RNA及过表达腺病毒,转染Ao SMCs,在细胞水平构建circ SATB2＿015的敲减和过表达模型,q RT-PCR实验验证敲减、过表达效率;2)通过Beyo Click TM Ed U-594检测circ SATB2＿015敲减或过表达对Ao SMCs增殖能力的影响;3)通过划痕愈合实验检测circ SATB2＿015敲减或过表达对Ao SMCs水平迁移能力的影响;4)通过Transwell迁移实验检测circ SATB2＿015敲减或过表达对Ao SMCs垂直迁移能力的影响;5)通过q RT-PCR、免疫印迹实验(western blot),检测circ SATB2＿015敲减或过表达对Ao SMCs分化标志物表达水平的影响;6)建立小鼠颈动脉导丝损伤模型,损伤处灌注circ SATB2＿015过表达腺病毒或对照病毒,通过HE染色评估circ SATB2＿015对导丝损伤后血管内膜增生的影响。结果:1)Circ SATB2＿015-si RNA-1敲减效果可靠,可将circ SATB2＿015表达下调至0.1以下,circ SATB2＿015腺病毒滴度为100 MOI时,circ SATB2＿015的表达水平可升至90倍,且si RNA及过表达腺病毒均不影响宿主SATB2的表达;2)Beyo Click TM Ed U-594检测显示,敲减或过表达circ SATB2＿015可以分别促进或抑制Ao SMCs的增殖活性;3)划痕愈合实验表明,敲减或过表达circ SATB2＿015可以分别促进或抑制Ao SMCs的水平迁移能力;4)Transwell迁移实验表明,敲减或过表达circ SATB2＿015可以分别促进或抑制Ao SMCs的垂直迁移能力;5)QRT-PCR、western blot实验结果表明,敲减或过表达circ SATB2＿015能够抑制或促进Ao SMCs中α-平滑肌肌动蛋白(ACTA2)、钙调蛋白1(CNN1)和肌动蛋白相关蛋白22-α(SM22-α,TAGLN)的表达;6)灌注circ SATB2＿015过表达腺病毒能够显著抑制小鼠颈动脉导丝损伤后VSMCs的表型转化,缓解内膜增生。结论:通过转染si RNA和过表达腺病毒,在Ao SMCs中敲减、过表达circ SATB2＿015,结果表明circ SATB2＿015能够抑制Ao SMC增殖、迁移,促进Ao SMCs向分化表型转化;动物水平上,circ SATB2＿015过表达能够显著抑制小鼠颈动脉导丝损伤后VSMCs的表型转化,改善内膜增生。第三部分:Circ SATB2＿015通过调控mi R-9-5p/myocardin通路促进血管平滑肌细胞分化方法:1)通过mi Randa软件预测mi RBase数据库中可能与circ SATB2＿015结合的mi RNAs,并使用加尾法、茎环法设计mi RNAs引物;2)QRT-PCR验证目标mi RNA在增殖、分化模型中的表达;3)QRT-PCR验证敲减或过表达circ SATB2＿015对目标mi RNA的表达调控;4)Circ RNA-mi RNA FISH共定位确定circ SATB2＿015与目标mi RNA的结合关系;5)通过RNA结合蛋白免疫沉淀实验(RIP)实验明确Ago2蛋白能否结合circ SATB2＿015及目标mi RNA;6)设计合成针对circ SATB2＿015反向剪接位点的生物素标记RNA探针,通过RNA-RNA pull-down实验证明circ SATB2＿015与目标mi RNA直接结合;7)设计合成目标mi RNA的mimic及inhibitor,q RT-PCR验证过表达、敲减效率;8)设计合成circ SATB2＿015野生型、突变型双荧光素酶报告基因质粒,通过双荧光素酶报告基因实验进一步验证circ SATB2＿015与目标mi RNA的结合位点;9)通过Beyo Click TM Ed U-594检测目标mi RNA mimic及inhibitor对Ao SMC增殖的影响;10)通过划痕愈合实验检测目标mi RNA mimic及inhibitor对Ao SMC迁移的影响;11)通过q RT-PCR、western blot,检测目标mi RNA对Ao SMCs分化标志物表达水平的影响;12)通过mi RPath B、Targetscan以及mi Rwallk网站预测目标mi RNA下游的靶基因;13)通过q RT-PCR、western blot检测mi RNA对下游靶基因的表达调控作用;14)设计合成含靶基因3’UTR结合序列的野生型、突变型双荧光素酶报告基因质粒,通过双荧光素酶报告基因实验验证mi RNA与下游靶基因的结合关系;15)通过q RT-PCR、western blot实验检测circ SATB2＿015对靶基因的表达调控作用。结果:1)Mi Randa软件预测提示circ SATB2＿015与hsa-mi R-9-5p有两个结合位点,序列在人、小鼠中保守;2)PDGF-BB可引起mi R-9-5p时间依赖性上调,而SMDM分化培养可引起mi R-9-5p时间依赖性下调;3)敲减或过表达circ SATB2＿015能够分别促进或抑制Ao SMCs中mi R-9-5p的表达;4)Circ RNA-mi RNA FISH共定位实验显示circ SATB2＿015与mi R-9-5p在Ao SMCs中共定位于胞浆;5)RIP实验显示,相比Ig G组,circ SATB2＿015和mi R-9-5p在Ago2抗体组显著富集;6)RNARNA pull-down实验表明,相比阴性探针组,circ SATB2＿015和mi R-9-5p在circ SATB2＿015生物素探针组均显著富集;7)转染mi R-9-5p的mimic及inhibitor能够明显提高或降低Ao SMCs中mi R-9-5p的表达水平;8)双荧光素酶报告基因实验显示,mi R-9-5p能够与circ SATB2＿015上两处结合位点结合;9)Beyo Click TM Ed U-594检测显示,mi R-9-5p的mimic或inhibitor可以分别促进或抑制Ao SMCs的增殖活性;10)划痕愈合实验表明,mi R-9-5p的mimic或ihibitor可以分别促进或抑制Ao SMCs的水平迁移能力;11)QRT-PCR、western blot实验结果表明,mi R-9-5p能够抑制Ao SMCs中分化标记物(ACTA2、CNN1和TAGLN)的表达;12)Mi RPath B、Targetscan以及mi Rwallk预测发现心肌素(myocardin,MYOCD)可能为mi R-9-5p下游靶基因,q RT-PCR、western blot实验结果表明,mi R-9-5p能够负向调控Ao SMCs中MYOCD的表达;13)双荧光素酶报告基因实验表明,mi R-9-5p可以直接与MYOCD的3’UTR结合(位点1,1756-1763;位点2,5225-5231);14)QRTPCR、western blot实验结果表明,敲减或过表达circ SATB2＿015能够分别抑制或促进Ao SMCs中MYOCD的表达。结论:1)RIP、RNA pull down以及双荧光素酶报告基因实验表明,circ SATB2＿015能够吸附mi R-9-5p并负向调控其表达;2)Mi R-9-5p mimic、inhibitor转染Ao SMCs后的功能实验表明,mi R-9-5p能够促进Ao SMC增殖、迁移,抑制Ao SMCs向分化表型转化;3)Mi R-9-5p能够靶向分化基因MYOCDauthentication of biologics的3’UTR区,阻断其m RNA及蛋白表达。Circ SATB2＿015通过海绵机制负向调控mi R-9-5p的表达,从而解除mi R-9-5p对靶基因MYOCPF-03084014核磁D的抑制作用,促进Ao SMCs向分化表型转化。第四部分:Circ SATB2＿015通过抑制YBX1的SUMO化修饰阻断CDK1的转录激活,从而抑制血管平滑肌细胞增殖方法:1)设计合成针对circ SATB2＿015反向剪接位点的生物素标记RNA探针,通过RNA-蛋白pull-down实验、银染及蛋白质谱分析,探索circ SATB2＿015直接结合的蛋白,并进行功能富集分析;2)通过Cat RAPID、RBPmap网站预测circ SATB2＿015与YBX1的结合位点;3)QRT-PCR、western Blot检测PDGF-BB、circ SATB2＿015对Ao SMCs中YBX1 RNA及蛋白水平的表达调控;4)通过放线菌酮(CHX)、MG132处理评估circ SATB2＿015对YBX1稳定性及泛素化降解的影响;5)通过Uni Prot网站探索YBX1的表观修饰类型,SUMO sp 2.0.预测YBX1的SUMOylation位点,通过Cat RAPID网站预测circ SATB2＿015与SUMO2的结合位点;6)通过western blot检测circ SATB2＿015对Ao SMCs中SUMO2蛋白水平的影响;7)通过western blot检测circ SATB2＿015 pull down产物中YBX1及SUMO2蛋白的富集情况;8)通过RIP实验,检测YBX1及SUMO2抗体拉下的RNA产物中是否存在circ SATB2＿015富集;9)通过RNA FISH及IF实验,明确circ SATB2＿015与YBX1的胞内定位;10)Pairwise Structure Alignment软件预测YBX1与SUMO2结合的空间构象,蛋白免疫共沉淀(CO-IP)验证YBX1与SUMO2蛋白的直接结合;11)通过MG132处理评估SUMO2对YBX1稳定性及泛素化降解的影响;12)通过蛋白核质分提实验检测circ SATB2＿015对YBX1、SUMO2核质分布的影响;13)使用Jaspar网站预测YBX1与CDK1启动子区的结合位点;14)设计合成YBX1 si RNA及过表达质粒,并评估其对CDK1 RNA及蛋白水平的表达调控;15)通过q RT-PCR、western blot检测circ SATB2＿015对CDK1的表达调控作用。结果:1)RNA-蛋白pull down的蛋白银染结果显示,相比阴性探针组,circ SATB2＿015生物素探针组在多个蛋白条带处存在特异性富集,通过蛋白质谱及GO、KEGG分析发现,circ SATB2＿015结合蛋白在RNA binding、protein binding等分子功能富集;2)Cat RAPID、RBPmap网站预测显示,circ SATB2＿015在100-400nt与YBX1的结合能力最强;3)PDGF-BB、circ SATB2＿015不影响YBX1的m RNA水平,但YBX1在PDGF-BB刺激下蛋白水平呈时间依赖性升高,circ SATB2＿015敲减或过表达可增高或降低YBX1的蛋白水平;4)CHX抑制蛋白合成后,敲减circ SATB2＿015能够引起Ao SMCs中YBX1蛋白降解减慢,半衰期延长,circ SATB2＿015过表达引起的YBX1蛋白水平下调可以被MG132处理所阻断;5)SUMO sp 2.0.软件预测发现YBX1存在SUMOylation位点,Uni Prot网站预测YBX1存在SUMO2修饰位点,Cat RAPID软件预测显示circ SATB2＿015能够结合SUMO2蛋白,在100-300 nt二者结合能力最强;6)Circ SATB2＿015过表达或敲减不影响SUMO2的蛋白水平;7)通过western blot检测circ SATB2＿015的pull down产物,发现YBX1及SUMO2蛋白均明显富集;8)RIP实验结果表明,YBX1、SUMO2抗体拉下的RNA产物中均有circ SATB2＿015富集;9)RNA FISH及免疫荧光实验表明,circ SATB2＿015与YBX1蛋白在Ao SMCs胞浆共定位;10)CO-IP结果显示YBX1-IP组YBX1、SUMO2蛋白均明显富集,表明二者可直接结合;11)通过western blot实验证实SUMO2 si RNA敲减效果明显,SUMO2敲减后YBX1的蛋白水平明显下调,而MG132处理能够逆转这种下调;12)对Ao SMCs进行蛋白核质分提,western blot实验结果表明,敲减circ SATB2＿015后,胞浆及胞核YBX1蛋白水平均升高,而SUMO2蛋白在胞浆分布增多,在胞核分布减少;13)Jaspar预测网站显示,YBX1与CDK1的启动子区(正义链)有4个可能的结合位点;14)QRT-PCR及western blot显示Ao SMCs转染YBX1的si RNA、过表达质粒能够显著抑制或促进CDK1的表达;15)QRT-PCR、western blot实验结果表明,敲减或过表达circ SATB2＿015能够分别促进或抑制Ao SMCs中CDK1的表达。结论:1)Circ SATB2＿015能够同时结合YBX1、SUMO2形成复合体,抑制SUMO2修饰对YBX1的稳定作用,促进其泛素化降解;2)YBX1在细胞核可结合到CDK1的启动子区,激活其转录活性;3)Circ SATB2＿015通过蛋白支架作用抑制YBX1的SUMO化修饰,阻断下游CDK1的转录激活,发挥对Ao SMCs的增殖抑制作用。