目的:阐明AZT联合As_2O_3对肝癌HepG2、MHCC97-H细胞焦亡的影Gefitinib-based PROTAC 3纯度响,明确AQP9及FOXO1/Wnt-β-catenin信号通路在AZT联合As_2O_3诱导肝癌细胞发生焦亡过程中扮演的角色。旨在进一步理解AZT联合As_2O_3抗肝癌的分子机制,对临床应用AZT联合As_2O_3这种有效的抗肝癌组合方案具有重要的理论指导意义。方法:常规培养人肝癌HepG2、MHCC97-H细胞。采用CCK8法检测20μmol/L AZT、2μmol/L As_2O_3以及两药联合(20μmol/L AZT、2μmol/L As_2O_3)对HepG2、MHCC97-H细胞增殖的影响;ELISA试剂盒检测干预后各组细胞炎症因子IL-18的释放量;以脂质体GP为载体,分别对HepG2、MHCC97-H细胞转染AQP9 si RNA、FOXO1 si RNA,细胞分为空白对照、非特异对照(转染非特异序列)和目的si RNA(转染AQP9或FOXO1si RNA)3组;定量逆转录PCR(quantitative reverse transcription PCR,RT-qPCR)和Western Blot(WB)分别检测干预后各组细胞AQP9、FOXO1、β-catenin及细胞焦亡相关基因NLRP3、GSDMD和IL-18 mRNA及蛋白的表达。结果:1.在CCK8实验中,与阴性对照组(与用药组等量的DMEM)相比,各组肝癌细胞的增殖率在72h降低更明显(P<0.01),并且联合用药组比单独用药组细胞的增殖率下降更显著(P<0.01)。2.ELISA实验表明,与空白对照组相比,两株细胞用药组IL-18的释放量均明显增高(P<0.01),HepG2细胞中与As_2O_3组相比,联合用药组释放量更加明显(P<0.05),MHCC97-H细胞中与AZT组和As_2O_3组相比,联合用药组释放量更加显著(P<0.01或0.05)。3.单独或联合用药72h后,RT-qPCR及WB结果表明,与空白对照组相比,联合用药组NLRP3、GSDMD、IL-18 mRNA和蛋白水平显著升高(P<0.01)。联合用药组分别与AZT组、As_2O_3组比较,HepG2细胞NLRP3、IL-18 mRNA和蛋白表达量均显著增高,GSDMD蛋白表达量显著增高(P<0.01或0.05);MHCC97-H细胞NLRP3、GSDMD mRNA和蛋白表达量均显著增高(P<0.01或0.05)。4.RT-qPCR和WB实验检测细胞转染AQP9或FOXO1并联合用药干预相关mRNA和蛋白。(1)AQP9-NC组与MOCK组比较,两株细胞NLRP3、GSDMD及IL-18 mRNA和蛋白均高表达(P<0.01或0.05)。si-AQP9组与MOCK组相比,HepG2细胞NLRP3、IL-18 mRNA高表达,NLRP3、GSDMD蛋白高表达(P<0.01或0.05);MHCC97-H细胞NLRP3 mRNA明显高表达,而GSDMD mRNA显著表达,然NLRP3、GSDMD及IL-18蛋白均表达增高(P<0.01或0.05)。si-AQP9组与NC组相比,两株细胞FOXO1 mRNA和蛋白均低表达、β-catenin蛋白均高表达(P<0.01);HepG2细胞GSDMD mRNA表达显著降低,但IL-18 mRNA表达明显升高,NLRP3、GSDMD及IL-18蛋白表达均显著降低(P<0.01);MHCC97-H细胞NLRP3 mRNA和蛋白表达明显升高、而GSDMD和IL-18 mRNA和蛋白表达均显著降低(P<0.01或0.05)。(2)si-FOXO1组、NC组分别与MOCK组比较,两株细胞NLRP3、GSDMD及IL-18 mRNA和蛋白均高表达(PHepatocyte histomorphology<0.01或0.05)。si-FOXO1组与NC组相比,两株细胞β-catenin蛋白高表达(P<0.01);HepG2细胞NLRP3、GSDMD、IL-18 mRNA表达均显LEE011 molecular weight著升高,NLRP3、GSDMD蛋白表达明显升高,而IL-18蛋白表达明显降低(P<0.01);MHCC97-H细胞NLRP3、GSDMD mRNA表达均显著升高,GSDMD蛋白表达明显升高,而IL-18蛋白表达明显降低(P<0.01)。结论:(1)AZT联合As_2O_3可能通过FOXO1/Wnt-β-catenin信号通路诱导肝癌HepG2和MHCC97-H细胞发生焦亡;(2)AZT联合As_2O_3可能通过诱导肝癌细胞焦亡抑制其增殖。