能量稳态是蜜蜂的生长发育过程中抵抗疾病和应激来维持生存的根本。蜜蜂变态发育的蛹期禁食,主要靠储存在脂肪体脂滴中的脂解提供能量;蛹期也是脂肪体和中肠等组织器官重塑的关键时期。研究表明,自噬在细胞脂肪代mediating analysis谢和能量稳态以及蜜蜂组织变态中发挥作用,但其参与的具体过程和自噬相关基因(Autophagy-related genes,Atgs)的调控机制尚不清楚。本研究以意大利蜜蜂为研究对象,利用透射电镜、蛋白标记等技术探明蛹期发生自噬的组织器官,并通过抑制自噬,探索自噬对蛹期脂代谢和中肠重塑的影响;并利用分子生物学技术揭示Atg2B影响蛹期脂代谢的分子机制。主要研究结果如下:1.自噬对意大利蜜蜂蛹期脂代谢和中肠组织形态的影响移取一批1日龄(1 d)的工蜂幼虫置于24孔细胞培养板中,室内条件下人工饲养至羽化出房。刚完成蛹变的白眼蛹(White-eyed pupae,Pw)脂肪体细胞用于自噬标记蛋白微管相关蛋白1轻链3β(Map1lc3b/LC3,LC3)和脂滴的荧光共定位。选取预蛹(Prepupae,PP)、Pw和褐眼蛹(Brown-eyed pupae,Pb)阶段,利用RT-selleck合成q PCR检测lipase 1等脂解调控基因的表达;解剖中肠,利用透射电镜观察自噬体;利用RT-q PCR和WB检测LC3等自噬关键基因和蛋白的表达。7 d的幼虫随机分成3组,每组6个重复,进行自噬抑制剂处理,试验组分别注射10 m M 3-甲基腺嘌呤和5 m M氯喹各0.5μL/只;对照组注射等量的PBS。幼虫注射完毕后放入化蛹板并置于恒温恒湿(34℃,75%)培养箱中化蛹,解剖Pw的中肠,利用WB检测LC3等蛋白的表达量;Pb时取样利用LC/MS进行非靶向脂质组的测定。试验结果显示:1)Pw脂肪体细胞中自噬指示蛋白LC3和脂滴的荧光信号高度重合,蛹期饥饿诱导基因pepck1和fbp显著性高表达(P<0.05)以及p70 S6K磷酸化蛋白的低表达和AMPK磷酸化蛋白的高表达,表明工蜂蛹期受饥饿诱导脂肪体内发生脂噬;中肠透射电镜观察到自噬体以及预蛹阶段LC3-II/LC3-I显著性升高(P<0.05)和P62表达水平的显著性降低(P<0.05),表明预蛹阶段自噬启动了中肠重塑。2)工蜂蛹期TAG含量显著减少(P<0.05),TAG的经典动员途径中lipase 1和HSL、饥饿诱导基因pepck1和fbp、脂噬关键调控基因LC3、Atg2B和Atg9A以及中肠细胞源的糖反应性神经肽F(Neuropeptide F,NPF)、葡萄糖转运体(Glucose transporter 1,Glut1)、转录因子叉头盒O(Forkhead box protein O,Fox O)和脂动激素(Adipokinetic hormone,AKH)的显著性高表达(P<0.05),表明蛹期体液因子协调脂肪体和中肠进行脂解。3)蛹期抑制自噬,会导致蛹体内TAG等丰度升高,卵磷脂(Phosphatidylcholine,PC)等丰度降低,阻碍了蛹的脂解和PC的合成;还会导致新出房的蜜蜂中肠肠道皱缩,肠壁变薄,影响成虫中肠的形成。本试验结果表明,工蜂蛹期受饥饿诱导,活化脂肪分解酶和激活脂肪体内的脂噬促进脂解,伴随着自噬调控的中肠重塑,蛹期中肠也可能与体液因子协同促进脂解;蛹期抑制自噬,导致脂解受阻和中肠肠壁变薄,影响蛹的正常发育和成虫中肠的形成。2.Atg2B介导的脂噬对意大利蜜蜂蛹期脂解的影响及机制为了探究Atg2B对工蜂蛹期脂代谢活动的影响机制,移取一批1 d的工蜂幼虫置于24孔细胞培养板中,室内条件下人工饲养至Pw,随机分为4组,每组6个重复,试验组注射0.5μL/只的ds RNA-Atg2B,对照组分别为不注射、注射等量的H_2O和ds RNA-GFP,注射12 h后取样,RT-q PCR检测Atg2B等基因的表达。另选取Pw,随机分为3组,每组6个重复,试验组分别注射4μg/只的Atg2B的兔源多克隆抗体,对照组注射等量PBS以及兔血清免疫球蛋白Ig G,注射之后放入化蛹板并置于恒温恒湿(34℃,75%)培养箱中化蛹至Pb时取样,利用利用LC/MS进行非靶向脂质组的测定和LC-MS/MS技术鉴定总蛋白和脂滴蛋白并进行组间差异蛋白的KEGG富集分析;试验组剩余的蛹随机分为两组,分别注射PC或14-甲基十六烷酸(C17 anteiso acid,C17iso)进行挽救试验,注射之后放入化蛹板并置于恒温恒湿(34℃,75%)培养箱中化蛹直至出房,最后统计粉眼蛹的比例和羽化率。试验结果显示:1)沉默蛹Atg2B基因的表达,脂肪分解酶lipase1和lipase3以及脂噬的调控基因LC3和Atg9A的表达表达显著下调(P<0.05),但是脂滴结构蛋白基因Lsd2,Rab7和Rab18的表达表达显著上调(P<0.05),表明蛹体内的脂解活动减弱,保持了脂滴的完整性。2)抑制蛹体内Atg2B蛋白的表达,会导致蛹体内TAG丰度升高,PC等丰度降低,蛹发育停滞在Pw阶段,还会造成蛹中肠肠壁变薄,注射PC和C17iso显著增加了粉眼蛹的比例,表明阻碍了蛹的脂解和PC的合成,影响了蛹和中肠的发育。3)抑制蛹体内Atg2B蛋白的表达,蛹腹部自噬指示蛋白LC3的荧光信号变弱,脂肪体体积显著增大(P<0.05),表明脂噬活动减弱,脂滴的分解显著减少;Pb脂滴蛋白显著富集到脂肪酸合成信号通路,表明促进了蛹脂肪酸合成信号通路相关蛋白的表达,导致脂滴内TAG的积累,引起体内TAG的异常升高;Pb缺失的蛋白显著富集到的信号通路则为脂肪酸降解信号通路,表明抑制了蛹脂肪酸降解信号通路相关蛋白的表达,从而阻碍了脂肪酸的分解。本试验结果表明,工蜂蛹期抑制Atg2B的转录和翻译,会抑制蛹期体内的脂噬活动,阻碍蛹体内脂肪分解酶参与的脂解,导致蛹和中肠的异常发育。3.ame-miR-980-3p靶向Atg2B通过调控中肠自噬对意大利蜜蜂蛹期脂质吸收功能的影响为了探究Atg2B是否受到转录后调控从而对工蜂蛹期中肠自噬产生影响,移取一批只1 d的工蜂幼虫置于24孔细胞培养板中,室内条件下人工饲养至Pb,解剖PP、Pw和Pb阶段的中肠,每个阶段4个重复,共计12个样本通过Illumina平台进行进行micro RNA(miRNA)的测序。另选取7 d的幼虫,随机分为四组,分别腹部注射0.5μL/只的agomir、agomir-ame-miR-980-3p、antagomiMG132 IC50r和antagomir-ame-miR-980-3p,每组6个重复,注射之后放入化蛹板并置于恒温恒湿(34℃,75%)培养箱中化蛹,于PP、Pw和Pb阶段取中肠,利用RT-q PCR和WB检测LC3等自噬关键基因和蛋白的表达;冰冻切片用于5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2’deoxyuridine,Ed U)染色测定细胞增殖和尼罗红染色观察脂质分布等;中肠石蜡切片用于肠壁厚度的测量;透射电镜用于肠绒毛的观察。试验结果显示:1)中肠miRNA测序筛选到了靶向Atg2B的ame-miR-980-3p,ame-miR-980-3p在蛹期抑制Atg2B的表达和LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化,表明蛹期ame-miR-980-3p靶向Atg2B抑制中肠自噬。2)蛹期抑制ame-miR-980-3p的表达,Pb中肠细胞增殖Ed U荧光信号减弱,caspase-3酶活性显著增强(P<0.05),抑制了细胞的增殖和促进了中肠细胞的死亡。3)蛹期ame-miR-980-3p的异常表达均会导致新出房的蜜蜂的中肠肠壁变薄;抑制ame-miR-980-3p的表达,新出房的蜜蜂的肠绒毛明显变短且稀疏,Pb的围食膜中脂质信号几乎消失,表明成虫中肠发育不良且脂质吸收能力减弱。本试验结果表明,ame-miR-980-3p靶向Atg2B抑制工蜂蛹期中肠自噬,ame-miR-980-3p的异常表达会干扰中肠重塑过程中的细胞增殖和死亡,阻碍成虫中肠的形成,最终导致成虫中肠发育不良,影响中肠的脂质吸收功能。综上所述,脂肪体内的脂噬和中肠自噬参与的脂解供能是保证蜜蜂由蛹过渡到成蜂的必要生理活动;在脂肪体的脂噬中,Atg2B通过上调LC3和Atg9A的表达促进的脂噬,与中性脂肪酶参与的经典脂解途径,共同促进脂滴的脂解;在中肠自噬中,ame-miR-980-3p靶向Atg2B抑制自噬控制细胞死亡,促进细胞增殖,建立成蜂中肠,中肠和脂肪体通过体液因子协调全身能量的稳态,保障蛹羽化为成蜂。