帕金森氏病(Paselleck Lapatinibrkinson’s disease,PD)是一种常见的中枢神经系统退行性疾病,黑质纹状体多巴胺能神经通路退化被认为是疾病的核心病理。至今,以多巴胺替代为治疗原理的左旋多巴类药物仍然是缓解PD运动症状的金标药。几十年来,针对氧化应激、神经炎症和α-突触核蛋白沉积等关键病理的药物研发思路受到广泛关注,至今尚未取得突破性进展。脑微血管损伤广泛存在于包括PD在内的多种神经退行性疾病患者的脑中,越来越多的研究提示脑微血管损伤与神经退行性疾病的发生和发展密切相关。同时,在神经炎症的状态下,炎性小胶质细胞释放炎症因子诱导具有神经毒性的A1型星形胶质细胞的形成也被证明促进了PD等神经退行性疾病的进展。这就启发我们思考这样一个问题:病变脑微血管内皮细胞和A1型星形胶质细胞是各自独立参与神经退行性疾病,还是其关联后成为致病因素?本课题组长期致力于研究人参皂苷防治神经功能紊乱和神经退行性疾病的作用及其机制。前期研究发现,在线粒体复合酶Ⅰ抑制剂鱼藤酮诱导的PD大鼠模型中,脑微血管内皮细胞的炎症反应发生在胶质细胞病变和多巴胺能神经元退化之前。进一步的研究发现,在鱼藤酮诱导的细胞损伤模型中,脑微血管内皮细胞释放了大量炎症因子,且其条件培养基可以诱导A1型星形胶质细胞的形成。人参二醇皂苷组分(Panaxadiol saponin fraction,PDSF,主要含Rb1、Rb3和Rd)可以对抗鱼藤酮诱导的黑质纹状体中血管损伤和多巴胺能神经通路的退化以及运动功能障碍。综上所述,可以推测,线粒体复合酶I功能缺陷引发的脑微血管内皮细胞释放的炎症因子可能诱导A1型星形胶质细胞的形成,从而促进PD的发生和发展;PDSF可能通过保护神经血管单元,从而发挥防治PD的药效。为了验证以上推测,本论文在课题组前期研究的基础上进一步探索了以下四个方面的科学问题:1.脑微血管内皮细胞炎症是否通过诱导A1型星形胶质细胞的形成促进PD发生和发展;2.PDSF对脑微血管内皮细胞炎症以及其炎症介导的PD病理事件的影响;3.拟阐明在神经血管单元的主要成员中脑微血管内皮细胞对PD关键致病因素线粒体复合酶I功能缺陷最脆弱的原因;4.PDSF保护脑微血管内皮细胞抵抗线粒体复合酶I功能缺陷的作用机制。本论文主要研究内容和结果如下:1.鱼藤酮诱导的脑微血管内皮细胞炎症对PD发生和发展的影响。首先,用鱼藤酮分别诱导了脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元建立细胞损伤模型,确认了脑微血管内皮细胞对鱼藤酮损伤最敏感。随后,分别利用外源性炎症因子(包括肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α)、白介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)和白介素6(Interleukin-6,IL-6))模拟鱼藤酮诱导的炎性脑微血管内皮细胞条件培养基,以及通过si RNA沉默脑微血管内皮细胞的核因子κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)验证鱼藤酮损伤的脑微血管内皮细胞主要通过释放炎症因子诱导神经毒性的A1型星形胶质细胞的形成。研究结果证明,鱼藤酮通过激活脑微血管内皮细胞的NF-κB并释放炎症因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)诱导了A1型星形胶质细胞的形成,并进一步确认显著降低了A1型星形胶质细胞的吞噬功能,A1型星形胶质细胞释放的炎症因子加重了鱼藤酮对神经元的损伤。最后,利用动物模型进一步验证了炎性脑微血管内皮细胞引发的A1型星形胶质细胞的形成参与了线粒体复合酶I功能缺陷诱导的PD发生和发展。研究数据显示,在给予鱼藤酮的第二天(此时动物未出现行为变化),在黑质和纹状体就出现大量的炎性脑微血管内皮细胞,此时在炎症激活的微血管腔周围出现隐约可见的A1型星形胶质细胞;给予鱼藤酮的第十天(此时出现3级或以上PD运动障碍行为),大量A1型星形胶质细胞出现在炎症激活的微血管腔周围,与A1型星形胶质细胞吞噬功能降低的结果一致,此时在黑质和纹状体区域内出现了α-突触核蛋白沉积和多巴胺能神经元退化;给予鱼藤酮的第十五天,A1型星形胶质细胞数量、α-突触核蛋白沉积和多巴胺能神经元退化进一步增多。在此还要特别指出的是,小胶质细胞的激活出现在A1型星形胶质细胞形成之后。以上研究结果表明,鱼藤酮诱导的脑微血管内皮细胞炎症促进了A1型星形胶质细胞的形成,进而促进PD发生和发展。2.PDSF对鱼藤酮诱导的脑微血管内皮细胞炎症以及其炎症介导的PD病理事件的影响。首先利用细胞模型观测了PDSF对鱼藤酮诱导的脑微血管内皮细胞炎症反应及其连锁病理事件的影响,研究结果显示PDSF可以抑制脑微血管内皮细胞的NF-κB激活和释放炎症因子,而且这种被PDSF保护的脑微血管内皮细胞的条件培养基不会诱导A1型星形胶质细胞的形成,不仅避免了A1型星形胶质细胞的神经毒性并维持了星形胶质细胞的吞噬功能。在大鼠模型中,PDSF几乎可完全对抗鱼藤酮诱导的脑微血管内皮细胞NF-κB激活和炎症因子的产生,并预防A1型星形胶质细胞形成、α-突触核蛋白沉积和多巴胺能神经元损伤以及PD运动功能障碍。可见PDSF可保护线粒体复合酶I功能缺陷状态下的脑微血管内皮细胞,因此避免了炎性内皮细胞诱导A1型星形胶质细胞形成及其神经毒性和PD的发生和发展。3.探索脑微血管内皮细胞对鱼藤酮诱导的线粒体复合酶I功能缺陷易损的分子机制。线粒体能量代谢障碍、氧化应激和神经炎症与PD的发生和发展密切相关,然而三者之间的上下游关系尚不清楚。我们的前期研究发现鱼藤酮可以导致脑微血管内皮细胞三磷酸腺苷(ATP)水平低下。同时,尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸的总量(NADH+NAD~+,NAD(H))以及NAD(H)与尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的总量(NADPH+NADP~+,NADP(H))的比例(NAD(H)/NADP(H))呈现了数倍的升高,可见NAD(H)向NADP(H)的转化受到阻碍。由于,NAD(H)向NADP(H)的转化反应不仅依赖于ATP提供磷酸而且依赖ATP催化的尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶(NAD kinase,NADK),所以在此可以提出这样的科学假说:ATP不足可以导致NADK介导的NADP(H)合成障碍,进而导致还原型谷胱甘肽(GSH)转变为氧化型谷胱甘肽(GSSG)的再生障碍,发生氧化应激及其引发的炎症反应。据此,通过考察添加外源性ATP是否可以挽救鱼藤酮诱导的脑微血管内皮细胞内的氧化还原失衡、炎症反应和细胞毒性,结果发现外源性ATP可以使鱼藤酮诱导的线粒体复合酶I功能缺陷的脑微血管内皮细胞维持氧化还原平衡,并抵抗鱼藤酮诱导的炎症反应和细胞损伤。通过考察ATP对脑微血管内皮细胞NADK蛋白水平的影响,结果显示ATP不影响正常胞内的NADK水平但可显著对抗鱼藤酮诱导的胞内NADK水平下降。在此基础上,进一步发现了ATP可以延长NADK蛋白降解时间,揭示了ATP对维持脑微血管内皮细胞NADK水平的关键作用。最后,通过si RNA选择性下调NADK水平来观测ATP的上述保护作用是否依赖于NADK。与科学假说一致,下调NADK水平极大地削弱了ATP的相关保护作用。此外,NADK抑制剂硫代烟酰胺也可以极大地削弱ATP的相关保护作用。至此,我们可以得出这样的结论:ATP保护脑微血管内皮细胞对抗鱼藤酮的毒性的作用依赖于NADK,而NADK的蛋白稳定性依赖于ATP。4.PDSF保护脑微血管内皮细胞抵抗线粒体复合酶I功能缺陷的作用机制。首先,观测了PDSF抵抗鱼藤酮诱导脑微血管内皮细胞的ATP和NADK水平的降低以及GSH/GSSG和NADPH/NADP~+的比值失衡。研究数据显示,PDSF可显著对抗鱼藤酮诱导的ATP和NADK水平降低,并维持细胞内GSH/GSSG和NADPH/NADP~+的比值于正常水平。随后,通过si RNA NADK沉默脑微血管内皮细胞中NADK考察了PDSF是否通过NADK介导的抗氧化通路来维持胞内氧化还原稳态和抵抗鱼藤酮诱导的炎症反应。结果发现,NADK缺失几乎完全抵消了PDSF对抗鱼藤酮诱导氧化应激损伤和炎症反应。结合研究内容3的结果,上述结果表明维持胞内ATP和NADK水平对PDSF对抗鱼藤酮诱导脑微血管内皮细胞氧化应激损伤和炎症反应至关重要。为了探究PDSF的作用机制是否会调动细胞的“自救机制”,我们进一步观察了星形胶质细胞(这种细胞对鱼anti-hepatitis B藤酮毒性相对较耐受),研究它们在线粒体复合酶I功能缺陷时如何调节其ATP和NADK水平,以及其下游抗氧化物质的氧化还原平衡。研究数据显示,低浓度鱼藤酮(0.1μM)可降低脑微血管内皮细胞内ATP和NADK的水平,并伴随着NADPH/NADP~+和GSH/GSSG的氧化还原失衡和炎症反应。而鱼藤酮仅小幅降低星形胶质细胞的ATP水平、反而上调了NADK蛋白水平至超过正常水平并伴随氧化还原平衡和非炎症状态。进一步研究显示,NADK抑制剂硫代烟酰胺或si RNA NADK均极大地抵消了星形胶质细胞对鱼藤酮损伤的耐受性。上述研究结果说明,星形胶质细胞通过增强NADK介导的抗氧化通路是其对抗鱼藤酮诱导的细胞损伤的重要“自救机制”。所以,可以认为PDSF激活了脑微血管内皮细胞的这样一种“自救机制”。综上述研究结果,可以得出以下几点结论:1.在线粒体复合酶I功能缺陷引发的PD发生和发展过程中,脑微血管内皮细胞炎症反应及其诱导的A1型星形胶质细胞形成扮演着重要角色。2.线粒体复合酶I功能缺陷引发的脑微血管内皮细胞ATP不足导致了NADK的快速降解,NADK不足介导了氧化应激损伤和炎症反应,而星形胶质细胞通过激活NADK介导的抗氧化通路提高了其对线粒体复合酶I功能缺陷的耐受性。3.PDSF可保护线粒体复合酶I功能缺陷状态下的脑微血管内皮细胞,避免了炎性脑微血管内皮细胞诱导A1型星形胶质细胞形成及其神经毒性和PD的发生和发展。在此过程中,PDSF通过维持ATP水平和上调NADK水平,激活了NADK介导的抗氧化通路,从而提高了脑微血管内皮细胞对线粒体复合酶I功能缺陷的耐受性。本文研究结果不仅揭示了PDSF防治PD的新颖作用机制,从而进一步奠定了PDSF作为一种新型抗PD候选BLZ945供应商药物的科学基础,而且为研发新型抗PD药物提供了新思路。