研究背景及目的代谢重编程是炎症反应的重要发病机制,牙周病作为一种影响牙齿支持组织的炎症性疾病,在造成牙周组织破坏、引发宿主免疫和炎症反应的同时伴随着宿主细胞代谢状态的根本改变。Erastin糖酵解可为炎症反应迅速提供能量,并产生大量中间代谢产物用于免疫和炎症蛋白的生物合成,因此靶向糖酵解代谢可调控炎症反应水平。缺氧诱导因子-1α(hypoxia-induciblefactor-1α,HIF-1α)是糖酵解相关基因表达的关键转录因子,阐明影响HIF-1α表达的因素及调控机制可从代谢角度出发为炎症反应水平的调控开辟新的方向。本研究通过构建牙周炎体外模型,通过基因敲除、qPCR、WB、ELISA以及生物信息分析等手段,观察HIF-1α对人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts,hPDLFs)糖酵解代谢以及炎症因子表达的影响,并探讨影响HIF-1α表达的因素以及调控机制,为牙周炎以及牙周炎合并其他疾病背景下治疗靶点的选择提供新的理论基础。材料与方法1.构建HIF-1α-shRNA慢病毒,设置空载组(NC组),HIF-1α siRNA组、LPS 组和 LPS+HIF-1α siRNA 组,LPS 作用于 hPDLFs 6 小时后,qPCR、WB 检测HIF-1α以及糖酵解关键酶的表达;活性氧检测试剂盒检测hPDLFs内的ROS水平;ELISA检测各组上清液中IL-6、IL-1β的表达量。2.免疫荧光检测LPS作用下hPDLFs中的缺氧情况以及胞内Ca2+水平;设置对照组、LPS组、LPS+无钙培养基组、LPS+钙螯合剂组,qPCR、WB检测HIF-1α以及糖酵解关键酶的表达;ELISA检测各组上清液中IL-6、IL-1β的表达量。3.生物信息分析健康组与牙周炎组别以及与钙通路相关的差异基因;设置对照组、LPS组、LPS+无钙培养基组,qPCR、WB检测NF-κB、STAT3、EdnrA、EdnrB的表达;ELISA检测各组上清液中ET-1的表达量;使用STAT3抑制剂、EdnrA拮抗剂进行反向验证,qPCR、WB检测HIF-1α的表达。结果1.LPS作用下hPDLFs中HIF-1α以及糖酵解酶的表达增加,ROS水平上升,抑制HIF-1α后下调了糖酵解酶以及IL-6、IL-1β的表达。2.短时间、低浓度的LPS刺激下hPDLFs处于常氧状态,胞内Ca2+水平的增加是促进HIF-1α基因表达上调并稳定HIF-lα的因素。无钙培养基或钙螯合剂耗尽胞内外来源的Ca2+后显著下调了 LPS作用下hPDLFs中HIF-1α的mRNA及蛋白水平,同时也降低了糖酵解酶以及IL-6、IL-1β的表达。3.LPS作用下hPDLFs中NF-κB、STAT3在mRNA及蛋白水平显著增加,同时EdnrA和ET-1的表达也明显上调,而EdnrB无明显变化。无钙培养基的使用显著下调LPS作用下STAT3、EdnrA以及ET-1的表达,而对NF-κB以及EdnrB无明显影响。STAT3抑制剂降低了 LPselleckchem CanagliflozinS作用下HIF-1α的mRNA及蛋白水平,EdnrA拮抗剂的使用抑制了 LPS刺激下HIF-1α的蛋白表达。结论1.Plant stress biologyLPS作用下HIF-1α调控着人牙周膜成纤维细胞糖酵解代谢以及炎症因子的释放。2.短时间、低浓度的LPS刺激可稳定常氧状态下人牙周膜成纤维细胞中HIF-1α的表达,Ca2+是促进HIF-1α基因表达上调并稳定HIF-1α的因素,且胞内外来源的Ca2+均可影响HIF-1α的表达。3.调控Ca2+水平可通过影响HIF-1α的表达控制人牙周膜成纤维细胞的糖酵解代谢以及炎症因子的释放。4.LPS作用下,EdnrA参与调控人牙周膜成纤维细胞中Ca2+稳定HIF-1α的过程。STAT3信号通路可能是人牙周膜成纤维细胞中Ca2+调控HIF-1α基因表达的重要通路。