恒温扩增技术具有无需热循环仪、能够在恒温简单的条件下扩增核酸、反应效率和灵敏度高的特点,因此被广泛应用于生物传感器、食品安全、临床诊断等领域。本论文利用恒温扩增技术开发了3种新方法,分别用于相思子毒素、蓖麻毒素和大肠杆菌O157:H7的检测:一、提出了一种基于指数恒温扩增与生物条形码相结合的方法并用于相思子毒素的检测:(1)在磁性颗粒上修饰相思子毒素制备磁性探针,在胶体金纳米颗粒上修饰生物条形码和相思子毒素的抗体制备胶体金探针;(2)待测的相思子毒素能够与胶体金探针表面的抗体结合,竞争性抑制磁性探针–胶体金探针复合物的产生;(3)通过DTT洗涤,生物条形码会从复合物中释放出来,触发指数扩增反应;(4)通过实时荧光系统检测扩增产物进而实现multimedia learning相思子毒素的高灵敏检测。研究结果表明:该方法对相思子毒素检测的线性范围为10.0 ng L~(–1)–1.0 mg L~(–1)(R~2=0.9939),检测限为5.64 ng L~(–1)(3σ);对其他毒素、蛋白表现出良好的特异性,并对离子和蛋白酶表现出良好的抗干扰能力。对实际样品中的毒素分析结果表明本方法的应用前景良好。二、开发了一种基于指数恒温扩增结合3D–DNA Walker的方法并用于蓖麻毒素的检测:(1)分别采用冷冻法进行构建Walker探针和Track探针;(2)蓖麻毒素能与Walker探针竞争结合适配体,促进Walker探针和Track探针间的相对运动DNA Walker反应;(3)“识别–切割–相对运动”过程产生的ss DNA产物可Bucladesine MW以引发指数恒温扩增;(4)通过分子信标方法检测扩增产物进而实现蓖麻毒素的高灵敏检测。研究结果表明:该方法对蓖麻毒素检测的线性范围为10.0 pmol L~(–1)–50.0 nmol L~(–1)(R~2=0.9963),检测限为2.50 pmol L~(–1)(3σ)。该方法具有较好的特异性、重复性和稳定性,并在实际样品的毒素分析中展现出良好的性能。三、建立了一种基于Ui O66平台的CRISPR–Cas9引发双重恒温扩增反应的方法并用于大肠杆菌O157:H7的检测:(1)两个Cas9(H840A):sg RNA复合体识别并切割大肠杆菌O157:H7的毒力基因位点并形成缺口;(2)在缺口处发生的链置换反应可以循环产生短ss DNA产物;(3)环状探针与ss DNA杂交,通过滚环扩增合成带有重复序列的长ss DNA;(4)荧光探针远离Ui O66并与长ss DNA产物杂交,导致了荧光的恢复,实现对大肠杆菌O157:H7的高灵敏度、定量检测。研究结果表明:该方法对大肠杆菌O157:H7检测的线性范围为1.3×10~2–6.5×10~4 CFU m L~(–1)(R~2=0.9943),检测限是40 CFU m L~(–1)https://www.selleck.cn/products/SB-431542.html(3σ)。该方法对不同的致病菌展现出了优异的选择性。综上所述,我们成功开发了恒温扩增反应与其他技术联用的新方法用于检测生物毒素和致病菌,并具有良好的效果和实际应用潜力。我们相信随着恒温扩增技术的进一步发展,它在应用研究领域将有更广阔的前景。