4-羟基异亮氨酸(4-hydroxyisoleucine,4-HIL)能够降低胰岛素抵抗,促进胰岛素的分泌,具有潜在的治疗糖尿病的医疗应用价值。在实验室早期工作中,通过在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)SN01中表达来自苏云金芽孢杆菌的L-异亮氨酸羟化酶(IDO)基因ido,实现了利用菌株自身合成的L-异亮氨酸生产4-HIL的方法。本研究为了提高谷氨酸棒杆菌生产4-HIL的发酵能力和应用性,用D-丙氨酸营养缺陷替换了卡那霉素对质粒的筛选,避免卡那霉素的使用。向alr敲除菌SN01Δalr中转入了实验室前期构建好的ido与其它基因共表达的6个质粒并进行发酵比较,挑选出拥有较强4-HIL生产能力的菌株并利用正交试验优化了发酵培养基的组成。最后在2 L发酵罐上进一步优化发酵条件以提高4-HIL产量。主要研究内容和结果如下:1、为了在发酵过程中不添加抗生素,在菌株SN01中敲除丙氨酸消旋酶编码基因alr,向敲除菌中转入携带alr基因和ido基因的质粒p JYW4-ido进行回补,构建了菌株Δalr/p4-ido。使用该菌株在不添加卡那霉素的发酵培养基中进行发酵,结果表明,回补菌株Δalr/p4-ido在生长速率、糖耗和4-HIL生产方面和对照菌株SN01/p JYW4-ido(简称SN02)相比没有减弱,摇瓶发酵144 h能够生产79.93±1.95 m MLaduviglusib 4-HIL。经验证后,alr的敲除能够为菌株带来足够的筛选压力,能够避免发酵过程中抗生素的使用。2、为了挑选出4-HIL生产潜力高的发酵菌株,在SN01Δalr菌株中转入实验室前期构建好的6个ido表达质粒,得到6个重组菌株。通过摇瓶发酵和与原质粒构建菌株比较后,证实重组菌株Δalr-ILI3的生长和4-HIL产量都比较高。发酵144 h的PuromycinOD_(562)能达到121.6,在72 h能将葡萄糖耗完,4-HIL产量达到82.10±3.74 m M。3、为了提高重组菌株Δalr-ILI3在摇瓶水平上4-HIL的产量,通过单因素法和正交实验的方法对摇瓶中的初始培养基成分进行优化。进行单因素试验后初步确定了对4-HIL产量影响较Calakmul biosphere reserve大的组分酵母粉、甜菜碱和硫胺素的添加量范围。对酵母粉、甜菜碱、硫胺素和七水合硫酸亚铁进行正交实验确定初始培养基的最佳成分:当培养基中酵母粉浓度为3 g·L~(-1)、七水合硫酸亚铁浓度为1.1 g·L~(-1)、硫胺素浓度为1 mg·L~(-1)和甜菜碱浓度为2.5 mg·L~(-1)时,发酵144 h时的4-HIL产量为160.82±2.64 m M,与未优化时相比,4-HIL产量提高95.9%。4、为了提高重组菌株Δalr-ILI3在发酵罐水平上4-HIL的产量。在2 L发酵罐上进行发酵条件优化:对种子培养时间进行优化:生长时间为18 h的种子发酵96 h后,生成4-HIL 242.18m M,Ile 47.33 m M。4-HIL产量相比摇瓶水平提高50.6%。对发酵过程溶氧水平进行优化:溶氧水平从20.0%提升至30.0%,发酵88 h生成4-HIL 280.20 m M,相比摇瓶水平提高74.2%。对补料方式进行优化:使用浓缩8倍的初始培养基浓缩液进行补料,4-HIL的产量达到了324.72 m M,相比摇瓶水平提高101.92%。