海地瓜(Acaudina molpadioides)属于海参纲芋海参科棘皮动物门,是低值海参的一种,又称之为茄参。我国沿海均有分布,资源相当丰富。海地瓜体壁除了多糖、皂苷、胶原蛋白等化学成分之外,其体壁还含有多种活性多肽,具有降血压、防止肝损伤、降低脂肪肝及降血糖等多种生理功能,在食品、医疗等领域有很好的应用,目前有关海参的研究对象主要集中于对刺参、梅花参等经济价值较高的品种,对经济价值较低的海地瓜多肽研究国内报道不多。因此,本课题以利用价值较低的海地瓜为原料,利用基于低共熔溶剂的双水相溶剂系统对海地瓜降血糖肽进行分离富集,通过反向液相色谱技术和中压制备液相色谱技术联用对海地瓜降血糖肽进一步分离纯化,得到目标多肽。利用Edman降解法鉴定目标多肽的氨基酸序列,利用固相合成法合成目标多肽,应用α-淀粉酶活性抑制实验对海地瓜降血糖肽进行活性评价并探讨其构效关系。主要研究内容如下:(1)基于低共熔溶剂的双水相溶剂系统的参数优化以α-淀粉酶活性抑制实验为评价方法,考察低共熔溶剂的质量、海地瓜多肽的质量、分离时间、磷酸氢二钾浓度、温度、pH值等条件对海地瓜降Z-VAD-FMK血糖肽的分离富集效果影响,得到最佳分离富集条件。结果表明,最佳的双水相溶剂系统条件为低共熔溶剂质量为14 g,海地瓜多肽质量为200 mg,磷酸氢二钾浓度为0.95 g/mL,分离时间为150min,pH值没有影响,温度控制在15℃-40℃。(2)海地瓜降血糖肽的分离纯化通过基于低共熔溶剂的双水相溶剂系统对海地瓜进行降血糖肽的分离与富集,利用反相液相色谱和中压制备液相色谱对富集后的海地瓜降血糖肽进一步分离纯化,经过多次反复分离纯化,最终得到目标多肽:H11d-1。(3)目标多肽H11d-1的鉴定通过Edman降解法对目标多肽进行氨基酸序列的鉴定。结果表明:鉴定多肽氨基酸序列为:Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Thr/Ile-Gly-Ala-Gln,其中N端第六个位点氨基酸包含两个氨基酸Thr和Ile,同时含量较低,考虑可能修饰或其他结构,N端第九个位点氨基酸含量较低。利用高效液相色谱法对基于低共熔溶剂的双水相溶剂系统的参数优化结果进行验证,结果表明,最佳的双水相溶剂系统条件为低共熔溶剂质量为14 g,海地瓜多肽质量为200 mg,磷酸氢二钾浓度为0.95 g/mL,分离时间为150 min,pH值没有影响,温度控制在15℃-40℃。结果与上述(1)的结论一致。(4)目标多肽H11d-1的合成利用固相合成法合成H11d-1多肽,根据鉴定结果的多样性,合成Genetic inducible fate mapping四条多肽分别是:P1:Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Thr-Gly-Ala-GlnP2:Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Thr-Gly-AlaP3:Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Iler-Gly-Ala-GlnP4:Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Iler-Gly-Ala对四条多肽进行α-淀粉酶活性抑制实验评价。结果表明:P2、P3、P4对α-淀粉酶有抑制活性,具有降血糖作用,当浓度为22 mg/mL时,海地瓜降血糖肽P2、P3、P4对α-淀粉酶抑制率平均达到50%左右。经构效关系分析,目标多肽氨基酸序列中对α-淀粉酶起抑制作用的氨基酸可能是Gly、PrDecitabine体外o、Ala、Ile。