支气管哮喘是由炎性细胞参与引发的气道慢性炎症的过程,是一种慢性的呼吸道系统疾病,严重影响患者的生活质量和健康。其中抗炎治疗是哮喘管理的核心,通过降低气道的炎症反应,减少气道重塑和慢性损伤的发生,控制患者症状,降低患者发作次数,可以达到长期控制哮喘的目的。目的:目前传统的药物治疗或者免疫疗法虽然可以有效的控制哮喘的进程。但其缺点明显,比如传统的药物治疗如类固醇可能会引起一系列的副作用,支气管扩张剂甚至导致病情恶化,免疫疗法可能引起严重的过敏反应。因此,需要开发一种安全性高,效果良好的哮喘治疗新策略。基于siRNA(小干扰RNA)的纳米药物是一种潜在的控制哮喘的方法,晚期糖基化终末产物受体(RAGE)siRNA已被证明能够通过下调RAGE的水平而实现抗炎作用。姜黄素(Curcumin)具有免疫调节活性和抗炎作用,可避免载体本身带来的炎症刺激性。因此本论文构建了一种具有安全性且能够稳定递送药物的纳米载体,与RAGE siRNA结合制备纳米复合物,并评估其在支气管哮喘疾病治疗中的可行性,为哮喘的预防和长期控制提供一种新的治疗方法。方法:(1)前期研究中,通过微流控技术联合溶剂-反溶剂沉淀法制备包覆聚乙烯亚胺(PEI)的姜黄素纳米晶,同时建立并优化微流控法制备纳米晶的方法,为后续的实验建立统一的制剂标准。其次通过静电作用与siRNA结合制备Cur-PEI/siRNA纳米粒,并对其粒径(size)、多分散系数(PDI)、Zeta电位、结合亲和力进行考察确定最佳氮磷比(N/P)。琼脂糖凝胶阻滞实验评价了纳米粒的结合稳定性、酶稳定性和血清稳定性。TEM测试进一步观察Cur纳米晶和纳米粒的形状和表面形貌。(2)体外细胞实验中,通过荧光素酶(luciferase)活性检测实验在稳定表达Luciferase蛋白的4T1细胞上(小鼠乳腺癌细胞)验证了Cur-PEI/luci-siRNA递送系统的有效性,同时考察了血清浓度对转染的影响。随后使用CMT-167细胞(小鼠肺癌细胞)验证其转染有效性和生物安全性。运用CCK8法对纳米粒的细胞毒性进行评价,实时荧光定量PCR(q RT-PCR)在immune effect分子水平上进一步验证纳米粒转染的有效性。为深入研究纳米粒在细胞水平的行为,使用激光共聚焦和流式细胞术考察了纳米粒的细胞摄取效率和胞内的分布和转运情况。(3)体内动物实验运用“OVA法”构建小鼠哮喘模型,口服Cur-PEI/RAGE-siRNA纳米药物,通过q RT-PCR评估RAGE-siRNA干扰的有效性,同时关注了药物对小鼠体重的影响情况。结论:(1)第一章对纳米粒进行详细的考察和表征。微流控比混合法具有更稳定的纳米晶制备工艺(平均粒径在110 nm、PDI<0.2)。N/P=15(即PE更多I1800与siRNA的质量比)时Cur纳米晶与siRNA完全结合形成纳米粒(Cur-PEI/siRNA NPs),粒径增加至117 nm,分布均一(PDI<0.2),纳米粒携带19±1 mV的正电荷,有利于细胞转染。TEM测试显示纳米晶和纳米粒均为圆球形结构,Cur纳米晶表面光滑,而负载siRNA的纳米粒表面相对凹凸不平;纳米粒具有良好的储存稳定性,粒径在两周内几乎无变化;此外纳米晶保护siRNA免于酶降解和血清干扰,具有基因递送的前提条件。(2)体外实验结果显示,纳米粒安全性良好(IC50=6.31μ g/ml,是市售PEI25K的5-6倍。Luciferase细胞活性检测实验和实时荧光定量PCR(q RT-PCR)表明Cur-PEI/siRNA NPs具有与lipofectamine 2000、PEI25K相当甚至更高的siRNA干扰能力,即纳米递送系统的有效性。激Nirmatrelvir溶解度光共聚焦和流式细胞术指出与lipofectamine 2000、PEI 25K相比,纳米粒具有更高的细胞摄取效率。溶酶体共定位实验展示了纳米粒的入胞途径:细胞摄取纳米粒后首先聚焦细胞核周围,后期进入溶酶体中,由于PEI的“质子海绵效应”最终从溶酶体中逃逸至细胞质或细胞核发挥作用。(3)体内动物实验通过构建小鼠哮喘模型检测RAGE m RNA的表达水平初步验证了Cur-PEI/siRNA NPs对RAGE通路的干扰能力,证明了Cur纳米晶作为载体递送siRNA的稳定性和有效性。不含RAGE siRNA的Cur纳米晶组也大幅降低了RAGE-m RNA的表达水平,验证了具有抗炎作用的姜黄素和RAGE siRNA两者的协同作用。