背景与目的:抑癌基因丝氨酸/苏氨酸激酶11(Serine Threonine Kinase 11,STK11)又称为肝激酶B1(Liver kinase B1,LKB1),是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶。LKB1是调控细胞物质及能量代谢的关键分子,主要通过其激酶活性调控下游AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)及AMPK家族蛋白的磷酸化水平,以维持细胞的正常代谢状态并抑制肿瘤的发生和进展。LKB1在非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)中的突变率约为20%。LKB1失活突变型NSCLC具有侵袭性强、免疫抑制性肿瘤微环境及PD-L1低表达等特点,与放化疗和免疫治疗抵抗密切相关,严重影响患者生存。因Structuralization of medical report此,亟需寻找有效的治疗方案来提高LKB1失活突变型NSCLC患者临床获益。一项Ib/II期临床研究(NCT04203485)发现,小分子血管内皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂(Vascular endothelial growth factor receptor-Tyrosine kinase inhibitor,VEGFR-TKI)阿帕替尼联合免疫检查点抑制剂(Immune checkpoint inhibitors,ICIs)可以显著提高晚期NSCLC患者的生存。更为重要的是,相LY294002小鼠比于野生型(Wild type,WT)NSCLC患者,LKB1失活突变型NSCLC患者更能从该治疗中获益,然而其具体机制尚不清楚。本研究旨在探索阿帕替尼在LKB1失活突变型NSCLC治疗中的潜在作用机制,阐明临床上常用VEGFR-TKIs的作用差异,并通过分析LKB1失活突变型NSCLC的代谢特征,提出有效的治疗策略。材料与方法:1.使用LKB1表达缺失(LKB1-null)的NSCLC细胞株通过慢病毒转染构建LKB1重新表达的细胞株(LKB1-WT)。通过蛋白组学及磷酸化蛋白组学分析,筛选阿帕替尼在LKB1失活突变型NSCLC中的潜在作用靶点。2.通过蛋白质免疫印迹(Western blot,WB)实验验证阿帕替尼在LKB1-null的细胞中对AMPK的激活效应。通过表面等离子共振(Surface plasmon resonance,SPR)实验验证阿帕替尼与AMPK蛋白之间的相互作用关系。3.通过WB实验检测临床上常用的6种VEGFR-TKIs对AMPK的调控作用。通过均相时间分辨荧光技术(Homogeneous time resolved fluorescence,HTRF)检测26种VEGFR-TKIs对AMPK的调控作用的异同。通过计算机虚拟分子对接分析阿帕替尼及安罗替尼与AMPK的结合模式。4.通过生物信息学分析以及在常规培养/脱脂培养条件下的细胞增殖与毒性实验,检测LKB1-null NSCLC细胞中的脂肪酸代谢特征。5.通过~(13)C_6同位素葡萄糖标记的代谢流实验检测阿帕替尼对肿瘤细胞脂肪酸合成的抑制作用。6.通过细胞增殖与毒性实验、克隆形成实验、凋亡流式细胞术检测等方法分析阿帕替尼抑制肿瘤细胞增殖及诱导肿瘤细胞凋亡的作用。7.回顾性分析四例临床病例资料。四例患者均为STK11失活突变晚期NSCLC患者,且在后线治疗中均使用阿帕替尼单药或者联合治疗的模式。结果:1.在LKB1表达缺失的细胞中,阿帕替尼处理可显著提高AMPKα1 Ser496位点的磷酸化水平。阿帕替尼可直接结合并激活AMPK,且阿帕替尼与AMPK的结合力与激活剂A-769662接近。2.在临床上常用的VEGFR-TKIs中,阿帕替尼和安罗替尼可直接激活AMPK,阿昔替尼和舒尼替尼可直接抑制AMPK,而卡博替尼和仑伐替尼则对AMPK无调控作用。3.生物信息学分析表明在LKB1失活突变型NSCLC中,脂肪酸β-氧化、脂肪酸代谢、脂肪酸生物合成等脂肪酸代谢相关通路显著激活。细胞实验结果显示,单独抑制外源性脂肪酸的摄入或单独应用脂肪酸合成抑确认细节制剂均对LKB1失活突变型NSCLC细胞无显著杀伤作用。4.阿帕替尼通过激活AMPK促进下游蛋白乙酰辅酶a羧化酶(Acetyl-Co A carboxylase,ACC)发生磷酸化,可显著降低LKB1失活突变型NSCLC细胞中从头合成脂肪酸的比例。5.在脱脂培养的条件下,阿帕替尼的杀伤效应显著增强,可明显抑制LKB1失活突变型NSCLC细胞的增殖及存活,并诱导肿瘤细胞发生凋亡。6.三例患者的肿瘤标志物水平及局部肿瘤影像在接受阿帕替尼治疗期间保持较长时间的稳定。阿帕替尼单药或联合治疗可明显提高三例患者的无进展生存期(Progression-free survival,PFS)及一例患者的总生存期(Overall survival,OS);阿帕替尼联合吉非替尼的方案可改善一例STK11/EGFR共突变患者对吉非替尼的原发性耐药。结论:1.本研究筛选出AMPK是阿帕替尼在LKB1失活突变型NSCLC中的作用靶点,并验证阿帕替尼可直接结合并激活AMPK。2.本研究发现阿帕替尼和安罗替尼可以直接激活AMPK,阿昔替尼和舒尼替尼可以直接抑制AMPK,说明临床上常用的VEGFR-TKIs对AMPK有不同的调控作用。3.本研究发现LKB1失活突变型NSCLC存在明显的脂肪酸代谢紊乱;通过限制脂肪酸摄取联合阿帕替尼可能是针对LKB1失活突变型NSCLC的一种有效治疗策略。4.阿帕替尼可改善携带STK11失活突变的NSCLC患者的生存结局。