慢性束缚应激致小鼠体力疲劳模型的建立及莲须抗疲劳作用与机制研究

疲劳是一种持续的疲倦、虚弱或乏力的主观体验,可能是生理上的、精神上的、或两者都有。随着社会的进步和不断发展,人们的工作方式和生活节奏发生了明显改变,竞争所带来的生理和心理上的压力、以及不健康的生活方式均会导致机体的疲劳。现今疲劳已是一种普遍存在的健康问题,会严重影响人们的生活质量和工作效率。然而目前市场上缓解疲劳的药物并不充足,更加安全有效的抗疲劳药物和保健品亟需开发。此外,我国目前执行的缓解体力疲劳保健食品功能评价技术规范中所采用的评价方法是直接以正常动物给药后通过负重游泳造成急性体力疲劳,不能反映人们因长期遭受压力而产生的疲劳。莲须是睡莲科植物莲(Nelumbo nucifera Gaertn.)的干燥雄蕊,具有悠久的药用历史,在2020版《中国药典》中记载其功能与主治为“固肾涩精,用于遗精滑精,带下,尿频”,具有潜在的抗疲劳功效。然而,迄今为止对莲须的抗疲劳功效却没有相关研究报道,并且对莲须的化学成分亦鲜有研究报道。因此,本研究建立了一种采用慢性束缚应激(chronic restraint stress,CRS)来模拟人们由于长期遭受压力而导致的体力疲劳小鼠模型,并对其可能的发生机制进行了研究。并采用CRS小鼠疲劳模型、皮质酮所致小鼠肌肉功能障碍模型、地塞米松所致C2C12肌管细胞萎缩模型和急性运动性小鼠疲劳模型研究莲须抗体力疲劳的功效及作用机制。同时,采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱(ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time of flight-tandem mass spectrometry,UPLC-QTOF/MS)和高效液相色谱-紫外(high-performance liquid chromatography-ultraviolet,HPLC-UVDecitabine)技术对莲须的化学成分进行分析。本研究的主要内容如下:1 CRS致小鼠体力疲劳模型的建立及相关机制研究对ICR小鼠分别进行0、5、10和15天,每天8小时的CRS,应激结束后进行空场、前肢抓力和负重游泳测试。之后测定与疲劳相关的生化指标如肌糖原、肝糖原、及血清中的血糖、乳酸、尿素、乳酸脱氢酶和谷草转氨酶水平,从而确定CRS诱导疲劳的造模条件,并应用该条件对C57BL/6N和BALB/c小鼠进行适用性验证。采用转录组测序技术分析对照组与CRS造模15天小鼠的腓肠肌样本在基因表达上的差异。通过H&E染色和免疫组化染色观察腓肠肌纤维。采用电镜和Western blot等方法评价腓肠肌线粒体数量和功能、线粒体发生和线粒体自噬情况,对其可能的上游AMPK/mTOR信号通路进行研究,揭示CRS导致疲劳发生的可能机制。并通过给予小鼠自噬抑制剂氯喹验证CRS小鼠的疲劳与自噬间的关系。结果显示,与对照组相比,随着CRS时间的延长ICR小鼠的疲劳表现更加明显,共15天(每天8小时)的CRS可以造成小鼠稳定的空场自主活动、前肢抓力和负重游泳耐力降低等疲劳表现。在该条件下C57BL/6N和BALB/c小鼠也均表现出负重游泳耐力显著降低等疲劳表现,表明本条件可适用于多种品系小鼠的研究。15天的CRS可导致小鼠腓肠肌肌纤维萎缩和Ⅰ型肌纤维减少,使乳酸、乳酸脱氢酶和谷草转氨酶显著升高,尿素、肝糖原和血糖显著降低,说明CRS造成了小鼠体内代谢产物堆积、能源物质耗竭和组织损伤。腓肠肌转录组测序研究共发现了 239个差异表达基因,KEGG和GO富集分析显示,CRS可以引起小鼠能量代谢紊乱、并且可能与线粒体受损、自噬受阻和AMPK信号通路有关。进一步研究发现,CRS小鼠腓肠肌中的线粒体相关蛋白CYT-C、TOMM20、OXPHOS和MYH7降低,自噬相关蛋白PINK1和LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ表达降低,p62升高,表明线粒体受损和数量减少,且自噬受阻。通过给予小鼠自噬抑制剂氯喹发现当自噬受阻时会降低运动耐力,证明了 CRS小鼠的疲劳部分与自噬受阻有关。进一步发现CRS导致了小鼠腓肠肌p-AMPK、PGC-1α 和 TFAM 降低,p-AKT、p-mTOR 和 p-ULK1(Ser757)增加,表明CRS可以抑制AMPK/PGC-1α信号通路而导致线粒体生物发生受阻,并且导致mTOR/p-ULK1(Ser757)激活而抑制线粒体自噬,从而导致疲劳。2莲须对CRS所致小鼠体力疲劳的改善作用及机制研究连续15天灌胃给予ICR小鼠莲须(0.5和1.0g/kg)和阳性对照红景天,同时施以15天、每天8小时的CRS。随后通过检测小鼠前肢抓力和负重游泳耐力、小鼠体成分、腓肠肌H&E染色、血清乳酸、葡萄糖和乳酸脱氢酶水平评价莲须对CRS所致疲劳的改善作用及对腓肠肌的保护作用。并通过转录组测序、电镜、Western blot和RT-qPCR技术研究小鼠腓肠肌线粒体功能、线粒体发生、线粒体自噬和抗氧化应激水平等,阐明莲须改善疲劳的作用机制。结果显示,莲须给药后可以显著保护肌纤维,改善CRS所致的小鼠前肢抓力降低和负重游泳耐力降低,并且可以降低血清乳酸和乳酸脱氢酶水平、升高血糖水平。体成分及转录组测序提示了这与代谢途径、脂质生物合成过程和肌肉发育途径等多条通路的显著变化有关。莲须可以升高CRS小鼠腓肠肌MYH7、OXPHOS、PGC-1α、TFAM和TOMM20表达,从而提高线粒体数量和功能;还可以改善CRS小鼠腓肠肌 PINK1、LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ和 Beclin-1 的降低,改善 p62、p-ULK1(Ser757)和 p-mTOR的升高,从而促进线粒体自噬发生。而这些改变与莲须选择性地促进Sesn2表达而激活Sestrin2,进一步激活下游AMPK信号通路有关。此外,莲须还可以升高CRS小鼠腓肠肌Nrf2并抑制Keap1,进而上调NQO1、HO-1和Mn-SOD等抗氧化酶水平,降低氧化应激产物蛋白质羰基和MDA水平,从而降低氧化应激损伤。综上,莲须通过上调Sestrin2水平来激活AMPK和Nrf2,从而促进线粒体发生和线粒体自噬,增强抗氧化应激水平,改善CRS所致的体力疲劳功效。3莲须对糖皮质激素所致肌肉功能障碍和体力疲劳的改善作用研究首先测定莲须给药后的CRS小鼠皮质酮水平,探究莲须对CRS小鼠皮质酮紊乱的保护作用。并通过腹腔注射给予CRS小鼠皮质酮合成抑制剂美替拉酮,证明内源性皮质酮紊乱与疲劳发生的关系。皮下注射给予正常小鼠皮质酮,并灌胃给予莲须(1.0 g/kg生药),BMN 673 MW通过电镜、H&E染色和Western blot等对小鼠腓肠肌纤维及线粒体情况进行研究,探究莲须对皮质酮注射所致小鼠体力疲劳的改善作用。在体外,将C2C12小鼠成肌细胞分化成肌管细胞,添加地塞米松(80 μM)24h后造成肌管细胞萎缩并研究莲须(0.1、0.2和0.4 mg/mL)的改善作用,采用Western blot研究S estrin2等蛋白的表达情况。结果显示,莲须改善CRS所致的小鼠疲劳与调节皮质酮内源性紊乱有关。且莲须(1.0g/kg)可以显著改善外源注射皮质酮所致的小鼠疲劳,并通过升高皮质酮注射小鼠腓肠肌Sestrin2、TFAM、Nrf2和Mn-SOD水平而促进线粒体生物发生和提高抗氧化应激水平。莲须(0.1、0.2和0.4 mg/mL)对地塞米松(80 μM)诱导的C2C12肌管细胞活力均无影响,且能改善肌管细胞萎缩。莲须可以通过改善地塞米松所致的Sestrin2、Nrf2和TOMM20降低而改善线粒体功能障碍。综上表明,莲须对糖皮质激素所致的肌肉功能障碍和疲劳具有良好的改善作用。4莲须对急性运动所致小鼠体力疲劳的改善作用研究连续15天灌胃给予正常小鼠莲须0.5和1.0 g/kg(水提取物Cedar Creek biodiversity experiment88 mg/kg和176 mg/kg,下同)和阳性对照红景天,通过前肢抓力和负重游泳运动测试,评价了莲须对急性运动所致的体力疲劳的改善作用。并通过对小鼠体成分、肌糖原和肝糖原、及血清尿素、乳酸、乳酸脱氢酶和谷草转氨酶水平的检测对其抗疲劳的机制进行初步研究。结果显示,莲须给药后小鼠的前肢抓力和负重游泳耐力明显提升,且肌糖原和肝糖原水平升高,血清中的尿素、乳酸、乳酸脱氢酶和谷草转氨酶水平降低。结果表明,莲须可以通过增强小鼠能源物质储备、降低代谢产物积累、降低心肌和骨骼肌损伤,从而发挥抗体力疲劳的功效。5莲须的化学成分分析采用UPLC-QTOF/MS技术在负离子模式下对莲须提取物的化学成分进行分析鉴定,并采用HPLC-UV法在360 nm波长下对莲须所含的主要黄酮类化合物的含量进行测定。结果共鉴定出44种成分,其中有机酸类化合物6种,黄酮类化合物20种,单萜苷类化合物6种,长链脂肪酸类化合物12种。含量测定结果显示莲须中芦丁、金丝桃苷、紫云英苷、檞皮素和山柰酚的含量分别为86.57、60.13、231.34、62.88和146.28 mg/100g。该研究为莲须未来的开发和应用提供了更为明确的物质基础。综上,本研究建立了 CRS所致的小鼠体力疲劳模型,并揭示了其发生与线粒体稳态失衡有关;采用CRS小鼠疲劳模型、皮质酮所致小鼠肌肉功能障碍模型、地塞米松所致C2C12肌管细胞萎缩模型和急性运动性小鼠疲劳模型首次发现了莲须具有良好的抗体力疲劳的功效,并从线粒体稳态和抗氧化应激角度揭示了其抗疲劳的机制。本研究为缓解压力所致体力疲劳的功效产品筛选提供了一个稳定的动物模型和机制上更深的认识,并为莲须开发为抗体力疲劳药物或保健食品奠定了坚实基础。