肌萎缩性侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一种进行性神经退行性疾病。通常,该疾病的症状最初表现为远端肌肉的肌无力和萎缩,可仅限于单个肢体,接着症状逐渐波及全身。最终,因呼吸肌无力和呼吸衰竭而导致全身瘫痪并致死。流行病学统计分析表明,90%的ALS病例为散发性(s ALS),其余10%为家族性(f ALS)。两者的临床表现和病理特征基本相似(一般认为散发性和家族性ALS可能具有共同的病理机制)。尽管大多数ALS的病因尚不清楚,但大量研究证实,f ALS中20%的病例中与编码细胞质中SOD1蛋白(铜/锌超氧化物歧化酶)的基因突变有关。ALS的病理特征是运动皮层、脑干和脊髓的运动神经元(motor neurons/MNs)发生变性丢失。目前关于ALS的致病理论很多,包括细胞兴奋性毒性、自噬、氧化应激、线粒体功能障碍、免疫和炎症、突变型SOD1蛋白毒性、轴突转运障碍、胶质细胞异常、RNA代谢异常等。研究发现,ALS患者神经胶质细胞数量明显增多,提示这些细胞在疾病的病理过程中发挥了关键作用,而针对神经胶质细胞的治疗方法也成为当前ALS研究的热点之一,进一步探究这些细胞的作用,有望为ALS治疗提供更多的靶点。内皮素-1(Endothelin-1/ET-1)是一种分泌性的信号肽,已有研究证实其在包括大脑在内的多种组织中发挥作用,然而ET-1在一些神经变性病中,例如在ALS中的作用尚不清楚。ET-1被认为是最强有力的血管活性肽,在外周系统介导血管收缩作用,除此之外,ET-1还参与胚胎发育、前列腺细胞生长及癌变、胃肠道和内分泌功能。ET-1有两个膜结合受体为内皮素A(Endothelin A/ET-A)和内皮素B(Endothelin B/ET-B)。先前的临床研究表明脑卒中患者的脑脊液(cerebrospinal fluid/CBF)和血浆中ET-1的表达水平明显升高,这也说明ET-1在脑缺血的发病机制中起重要作用。在多发性硬化动物模型中,星形胶质细胞中ET-1过表达的小鼠会发生更严重的实验性过敏性脑脊髓炎(EAE)。而在ALS中,ET-1的表达情况、与疾病进展的关系及在疾病的作用机制同样值得我们去探究。因此在我们的研究中,我们首先检测了转基因小鼠SOD1-G93A(TransgenicSOD1-G93A mice/TgSOD1-G93A)腰髓中ET-1,ET-A和ET-B受体的表达和细胞定位。这些分子的表达分布表明神经元和星形胶质细胞都参与了疾病的发展过程,内皮素受体(ET receptors/ET-Rs)的表达变化可能与运动神经元变性有关。同时,ET-1的表达上调可能对疾病的发展起到重要作用,进一步研究这些分子的功能和相互作用,有望为疾病的治疗提供新的思路和方法。接下来,我们将ET-1对于运动神经元的作用扩展到了体外实验,进一步探讨了ET-1对体外培养的NSC34(neuroblastoma/spinal cord hybrid cell line)-hSOD1G93A细胞模型的作用机制。最后我们的结果发现,ET-1对NSC34-hSOD1G93A细胞有毒性作用,选择性ET-A受体拮抗剂BQ123或ET-B受体拮抗剂BQ788可以逆转ET-1造成的运动神经元损伤,这也提示临床应用ET-Rs拮抗剂可能是治疗ALS的一种潜在策略。生物标志物可以反映出某种疾病的病理生理过程,或者反映出药物的治疗效果。通过测量这些标志物的水平,我们可以了解药物是否起到了预期的作用,以及对疾病的影响程度。蛋白质组学技术是一种能定量检测蛋白的表达、定位、结构及蛋白间相互作用规律的科学,其能对寻找一定实验条件下的生物标志分子提供数据支持。在我们的实验中,前期通过ALS模型在体内检测ET-1及其受体的表达后,我们selleck化学构建了用于ET-1干预的体外模型。接下来,使用蛋白质组学分析技术检测分析了与ET-1干预ALS疾病模型相关的调控蛋白及分子通路,结果发现与未用ET-1处理的NSC34-hSOD1G93A细胞相比,细胞经ET-1干预后,有110种差异表达蛋白(differentially expressed proteins/DEPs)被调控,其中54种蛋白上调,56种蛋白表达出现下调。我们通过生物信息学分析发现经ET-1干预后筛选出来的通路均与细胞信号传递、细胞生长、细胞增殖等生物学过程相关。综上,我们得出的这些结果为ET-1在ALS中的潜在作用提供了研究方向和线索,并为ALS发病机制中针对运动神经元损伤提供了一个新的有前景的治疗靶点。第一部分ET-1及其受体ET-A,ET-B在SOD1-G93A小鼠模型中的表达及细胞定位目的:观察在SOD1-G93A小鼠模型中,不同发病阶段的ET-1、ET-A和ET-B的分子表达情况,以及这三种分子的细胞定位。方法:1.选取实验对象:1)SOD1-G93A转基因小鼠及其非转基因同窝小鼠(Nontransgenic mice/NTG);2)通过实验观察及查阅文献可知,SOD1-G93A小鼠在12周龄左右后肢运动症状表现较明显,并在17-20周持续进展到终末期。在本研究中结合我们的实验观察,选取了SOD1-G93A小鼠三个预先定义的阶段:(1)出生后40天(40d),没有运动缺陷的迹象;(2)出生后80天(80d),有运动缺陷的初始征象;(3)终末期(end stage),使动物仰卧或侧卧后在30秒内不能自行翻转。所有动物在相同条件下(光照/黑暗交替12小时,室内温度24±2℃,相对湿度50%-60%,不限制水和食物)成组饲养(4-5只小鼠/笼)。2.NTG小鼠和SOD1-G93A小鼠的腰段组织取样,冷冻切片制备和蛋白的提取。将用于免疫组织化学和免疫荧光的样品经4%多聚甲醛灌注固定取材。并在-80℃冰箱中保存待用。而将用于蛋白质印迹的新鲜未灌注的组织样本快速冷冻在液氮中,并储存在-80℃的超低温冰箱中以备用。3.用冰冻切片机(CM1850)将腰椎节段(L3-5)切成冠状切片(25μm厚)。免疫组织化学方法检测ET-1及其受体ET-A、ET-B在SOD1-G93A小鼠模型中的表达,免疫荧光法检测细胞定位。4.提取腰段蛋白并用Western blot方法检测ET-1及其受体ET-A,ET-B在SOD1-G93A小鼠模型中的蛋白表达情况。结果:1.免疫组化的结果显示,ET-A主要定位于细胞核上,并且在神经元上和胶质细胞上都有表达,和NTG小鼠相比,在SOD1-G93A小鼠中,随着疾病进展,表达ET-A的运动神经元减少,而表达ET-A的细胞核的总数增加;此外,我们发现ET-B受体主要位于运动神经元的细胞质中。在SOD1-G93A小鼠中,随着疾病的进展,ET-B的表达明显降低;在SOD1-G93A小鼠的腰髓中观察到表达ET-1的阳性细胞数量显著增加,并且这些细胞是神经胶质样细胞,尤其是在疾病的末期表达明显增多。2.Western blot结果显示,和NTG小鼠相比,在SOD1-G93A小鼠中,随着疾病进展,ET-1表达增高,而ET-A及ET-B表达降低,其中,与NTG相比,ET-1和ET-B的终末期表达变化有统计学意义。3.免疫荧光结果显示,ET-1主要表达于SOD1-G93A终末期小鼠的增生的星形胶质细胞中,这一结果我们课题组前期实验已经检测并证实过,并且在相关的文献也有研究和阐述;在本部分实验中发现ET-A主要表达于细胞核,在SOD1-G93A小鼠的终末期,表达ET-A的运动神经元明显减少,在成熟的少突胶质细胞和增生的星形胶质细胞中可见ET-A的表达,并且在小胶质细胞也能看到ET-A的表达;ET-B主要表达于运动神经元的细胞质中,在成熟的少突胶质细胞中可见ET-B表达,在增殖的星形胶质细胞中偶有ET-B表达,在小胶质细胞中无明显表达。结论:1.运动神经元是正常NTG腰髓中表达ET-A和ET-B受体的主要细胞,并且它们会随着疾病的进展出现表达降低。2.定量分析表明,Neun标记的运动神经元的丢失与SOD1-G93A小鼠终末期脊髓中ET-A和ET-B表达的降低有关,这在很大程度上解释了由于SOD1-G93A运动神经元的变性而导致的ET-A和ET-B的降低。3.增生性的胶质细胞中ET-A和ET-B的表达可能部分补偿了二者在运动神经元上表达的减少。4.神经胶质细胞和神经元在ET-1/ET-Rs通路变化中发挥作用,从而参与ALS的发病机制,为我们下一步的研究提供方向和思路。第二部分ET-1受体ET-A,ET-B在NSC34-hSOD1G93A细胞中的表达及ET-1的细胞损伤作用目的:本部分实验研究将利用NSC34-hSOD1G93A细胞模型研究ET-1的作用及受体ET-A和ET-B在体外细胞的表达情况,为ET-1在ALS中的作用机制研究提供更多思路。方法:1.选择实验模型:使用NSC34-hSOD1G93A细胞模型,检测细胞模型的转染效率和转染蛋白的表达,验证细胞模型是否构建成功。2.普通光学显微镜下观察三组细胞,NSC34-E(GFP-empty vector),NSC34-hSOD1WT(GFP-humanSOD1 wild type),NSC34-hSOD1G93A的形态从而进一步区别三组细胞的生长及形态特点。3.用CCK-8法检测三组细胞的细胞活力并比较他们之间的差异。4.使用免疫荧光技术检测MAP1B、c FOS、SOD1、ET-A和ET-B在三组细胞的表达情况。5.通过CCK-8方法观察ET-1对NSC34-hSOD1G93A细胞活力的影响以及使用ET-1选择性受体抑制剂后对细胞的影响。6.使用免疫荧光技术检测ET-1与ET-1选择性受体抑制剂共同干预作用对NSC34-hSOD1G93A细胞的ET-A,ET-B表达的影响。7.使用Western blot技术检测ET-1干预及ET-1选择性受体抑制剂共同作用下NSC34-hSOD1G93A细胞的ET-A,ET-B表达情况。结果:1.证实了ALS细胞系模型的构建成功。Western blot结果显示,NSC34-hSOD1WT和NSC34-hSOD1G93A均表达GFP-humanSOD1(GFP-hSOD1)融合蛋白,而在NSC34-E细胞中仅表达GFP。通过免疫荧光染色检测GFP和DAPI,进一步证实了转染的成功。GFP表达阳性的NSC34细胞比例平均为61±3%(NSC34-E),66±4%(NSC34-hSOD1WT),55±9%(NSC34-hSOD1G93A)。2.CCK-8检测显示,与NSC34-E细胞相比,NSC34-hSOD1G93A细胞的细胞活力显著降低。此外,与NSC34-hSOD1WT或NSC34-E细胞相比,NSC34-hSOD1G93A细胞表现出较差的形态分化,其特征是在细胞接种24h后可见清晰区分的延伸的神经突较少。3.免疫荧光结果显示,在NSC34-hSOD1G93A细胞组中,MAP1B标记的细胞轴突分化差,c FOS蛋白表达增加,SOD1蛋白异常聚集,但三组细胞中ET-A受体和ET-B受体的表达无明显差异。4.通过检测ET-1对运动神经元存活的影响,细胞被处理了不同的时间点和不同浓度。当细胞用1、10、100和1000 n M ET-1干预时,孵育24 h后,三组细胞具有浓度依赖性的毒性作用。CCK-8的结果显示,随着ET-1浓度的增加,NSC34-hSOD1G93A细胞和NSC34-hSOD1WT的细胞活力下降,同样ET-1干预NSC34-E组细胞活力略有下降,但无统计学意义。当给予NSC34-hSOD1G93A细胞于100 n M ET-1 12 h、24 h、48 h后,对细胞造成的作用在24 h后不再出现明显的损伤。5.通过免疫荧光技术检测ET-1是否影响ET-Rs在细胞模型上的表达,其结果显示ET-1降低了NSC34-hSOD1G93A细胞中ET-A和ET-B的表达。当加入ET-A受体抑制剂BQ123或ET-B受体抑制剂BQ788时,ET-Rs的表达增高。进一步定量的Western blot结果显示NSC34-E、NSC34-hSOD1WT、NSC34-hSOD1G93A细胞间ET-A、ET-B表达无明显差异。ET-1干预后的NSC34-hSOD1G93A细胞ET-B表达显著降低,而ET-A表达无明显影响。此外,Western blot结果显示BQ788逆转了ET-1干预引起的ET-B表达减少。结论:1.病理性增加的ET-1可能有诱导神经元死亡的潜在风险,通过使用拮抗剂可能逆转其造成的有害影响。2.进一步研究ET-1/ET-Rs信号轴下游信号通路的变化和功能特异性有助于我们进一步了解ET-1分子在ALS中的作用机制。第三部分ET-1对NSC34-hSOD1G93A细胞蛋白表达调控的蛋白质组学分析及验证目的:为了研究ET-1/ET-Rs信号轴的可能发病机制,我们使用100n M ET-1干预的NSC34-hSOD1G93A(S)细胞、无任何干预的NSC34-hSOD1WT(WT)细胞及NSC34-hSOD1G93A(C)细胞进行了液相色谱-串联质谱的(LC-MS/MS)蛋白质组学分析。方法:1.样品制备:复苏后,将细胞培养3-5代,并在细胞处于最佳状态后进行后续实验。经过一系列处理后,收集细胞样本,并用BCA试剂盒检测蛋白质浓度。加入胰蛋白酶消化蛋白质样品,胰蛋白酶与蛋白的质量比为1:50,再消化4 h后备用。2.LC-MS/MS分析:对于全细胞蛋白质组学分析,胰蛋白酶肽加载在EASY-n LC1200 UPLC系统(Thermo Fisher Scientific)上。将胰蛋白酶肽溶解在溶剂A(0.1%甲酸,2%乙腈/水)中,用溶剂B(0.1%甲酸,90%乙腈)以8-23%(0-68分钟)、23-32%(68-82分钟)的梯度分离,直到32-80%(82-86分钟),然后在80%(86-90分钟)保持。采用纳米电喷雾离子源,在Orbitrap Exploris TM 480(Thermo Fisher Scientific)中进行分离分析。电喷雾电压为2.3k V,MS扫描范围为400-1200 m/z。然后,通过20 s动态排除,筛选出25个以上含量最高的前驱体进行进一步的MS/MS分析。HCD片段在27%的归一化碰撞能量(NCE)下操作。在Orbitrap中,碎片的分辨率为15,000,固定第一质量设置为110 m/z。自动增益控制(Automatic gain control/AGC)目标设置为100%,强度阈值为2E4,最大注入时间为Auto。3.生物信息学分析:为了进一步分析基于差异表达蛋白功能分类的层次聚类(如:Gene ontology/GO,Domain,Pathway),我们将富集后得到的所有类别及其P值进行整理,并将至少富集在其中一个聚类中的类别进行整理,P<0.05被过滤。我们用函数x=-log10(P值)变换滤波后的P值矩阵。最后,将这些x值针对每个功能类别进行z转换,并在Genesis中使用单向层次聚类(欧氏距离,平均链接聚类)进行聚类分析。4.Parallel Reaction Monitoring(PRM)分析:将样品进行蛋白提取,胰酶降解,LC-MS/MS分析,经数据处理后对折叠变化不小于1.2和P<0.05的蛋白质根据肽段匹配数、覆盖率、信号强度和二级图数进行风险评估。风险分为高、中、低三个梯度。肽残基分馏后,将它们电离到NSI离子源中,然后用Q Exactive TM Plus进行质谱分析。使用Skyline(v.21.1)处理得到MS数据。实验中的每个蛋白质都应用了一种、两种或多种独特的多肽进行定量分析。结果:1.在本实验中,与NSC34-hSOD1WT(WT)细胞相比,NSC34-hSOD1G93A(C)细胞中有322个差异表达蛋白(DEPs)上调,206个DEPs下调。与C(NSC34-hSOD1G93A)细胞相比,100 n M ET-1+NSC34-hSOD1G93A(S)细胞中有110个蛋白(54个上调蛋白和56个下调蛋白)被显著调节。在C/WT组中,DEPs富集于同种异体排斥反应、朊病毒疾病等重要通路中,而在S/C组中,DEPs特异性富集在hippo信号通路-多物种、Erb B信号通路等。在GO富集分析部分,C/WT组在细胞外区和突触间隙高度富集,而S/C组富集于Gul4-RING E3泛素连接酶复合物和核常染色质相关通路。在C/WT比较组中,蛋白酪氨酸激酶抑制剂活性和鞘磷脂磷酸二酯酶活性等分子功能发生了明显变化,而在S/C组中,更多的DEPs与异源跨膜转运蛋白活性、染色质DNA结合和MAP激酶活性有关。从生物bronchial biopsies过程富集来看,C/WT组线粒体膜组织、线粒体跨膜转运和有机磷生物合成过程显著富集,而S/C组细胞在对层流剪切应力的反应、有丝分裂细胞周期相变和药物输出中显著参与。2.GO的功能分类分析显示,S/C对比组的DEPs主要分布于细胞过程、生物调控、代谢过程、刺激反应、多细胞生物过程、发育过程、定位等生物学过程。基于细胞组分的DEPs主要富集在核常染色质和质子转运ATP合成酶复合物中。分子功能的丰富主要体现在与异种生物跨膜转运蛋白活性、MAP激酶活性、翻译抑制因子活性和染色质DNA结合相关的方面。然后,DEPs富集于药物输出、调节肠道吸收、细胞对层流剪切应力的反应、正向调节坏死细胞死亡、c2-甾体激素代谢过程、激素生物合成过程、hippo信号通路等生物过程。同时,KEGG分析表明,DEPs主要富集在hippo信号通路-多物种和ATP-binding cassette(ABC)转运蛋白通路中。综合这些结果,我们发现ET-1显著地调节了蛋白质代谢过程、信号转导和对刺激的反应。亚细胞定位分析显示,DEPs主要分布在细胞核(27.46%,30个蛋白)、细胞质(23.3%,27个蛋白)、线粒体(17.42%,19个蛋白)、胞外(12.88%,14个蛋白)和质膜(10.98%,12个蛋白)。该数据显示,除细胞核外,DEPs在细胞质中所占比例最大,其次是线粒体和细胞外。3.在PRM验证的差异蛋白中,我们发现经ET-1处理后Cdkn1b(P27)和Eif4ebp1在Erb B信号通路中表达明显下调。它们的上游分子Erb B4是受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases/RTKs)表皮生长因子(epidermal growth factor/EGF)亚家族的成员,其与细胞分裂和分化相关。蛋白测序的结果表明ET-1对NSC34-hSOD1G93A细胞的作用与上述蛋白的功能密切相关,ET-1主要通过影响细胞周期和对蛋白合成的调控来发挥相关作用。这些蛋白是ALS发病机制研究的预期靶点。结论:通过以上结果,我们阐明了Cdkn1selleckchem PF-07321332b(P27)和Eif4ebp1作为更全面地理解和识别ET-1干预后ALS发病机制的生物标志物的重要性。因此,我们绘制了ET-1/ET-Rs轴,通过Erb B4-Phosphoinositide3-kinase/serine/threonine kinase(PI3K/Akt)-mechanistic target of rapamycin kinase(m TOR)-Eif4ebp1或Erb B4-PI3K/Akt-P27通路诱导MNs损伤的示意图。通过结合我们的蛋白质组学数据和前期实验初步检测到的数据,后面的生物信息学分析让我们对ET-1干预ALS体外模型的机制有了更全面的了解,并且这是目前还没有研究解决的问题。在未来的研究中,为我们更多地了解Erb B4-PI3K/Akt-m TOR-Eif4ebp1或Erb B4-PI3K/Akt-P27通路的调控机制以及ET-1在ALS发病机制中的潜在作用提供明确的方向。