幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是世界上最常见的病原体之一,约60-90%的胃癌与幽门螺杆菌感染有关;脲酶是幽门螺杆菌定殖和侵染人体的毒力因子之一,抑制脲酶活性是降低幽门螺旋杆菌侵染、胃癌发病率的主要方法。植物来源的化合物是开发脲酶抑制剂的重要来源,现有研究已阐明不同植物提取物、单一组分的效果、抑制类型、作用位点、抑制动力学和热力学规律等相互作用,同时也发现植物提取物中多组分共存时的脲酶抑制率与对应浓度单一组分的抑制率存在明显不同,但多组分间的协同、叠加或拮抗作用对脲酶的抑制规律和作用机制尚不清楚,制约了天然脲酶抑制剂的开发和资源的高效挖掘;蒲公英为常用治疗幽门螺杆菌感染的药食两用植物,研究表明其提取物及单一组分具有抑制脲酶的作用,但作用成分未完全阐明,组分间的协同、叠加或拮抗作用对脲酶的抑制规律和相互作用机制需深入研究阐明。本文以蒲公英为试材,采用BMN 673采购高效液相色谱-质谱、分子对接和分子模拟和动物实验等方法,选取洋刀豆脲酶(JBU)和幽门螺杆菌脲酶(HPU)两种常用酶,研究了蒲公英不同提取物对幽门螺杆菌体内外抑制作用,筛选鉴定了蒲公英不同部位抑制脲酶作用成分,研究了蒲公英主要酚类化合物及组合对JBU和HPU抑制作用规律,通过小鼠体内试验,验证酚类组合协同作用效果,并探究了酚类组合脲酶抑制作用机制。主要研究结果、结论如下:(1)蒲公英提取物对幽门螺杆菌体内外抑制作用采用纸片扩散法和MIC/MBC试验,小鼠胃炎模型评价蒲公英提取物对幽门螺杆菌体内、体外抑制活性。结果表明,乙醇提取物(EE)抑制脲酶活性优于水提物(WE),EE和WE的IC_(50)值分别为0.56±0.02和1.53+0.15 mg/m L;运动性实验和黏附实验表明1/4MIC浓度的提取物均能有效抑制鞭毛运动和黏附因子的贴壁性,进而影响幽门螺杆菌的体外定殖。小鼠胃炎模型试验结果表明口服50和200mg/kg蒲公英乙醇提取物,每天一次,连续两周能够有效清除小鼠体内幽门螺杆菌(>50%),减少胃黏膜出血现象,保护胃黏膜上皮组织完整性。与模型小鼠相比,给药组中血液中免疫球蛋白G(Ig G)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)表达量降低,上述结果表明蒲公英乙醇提取物可以缓解胃部炎症。(2)蒲公英抑制脲酶作用成分筛选鉴定采用HPLC-MS/MS定性、定量分析蒲公英根、叶、花提取物中组分种类和含量,测定不同提取物脲酶抑制率,通过相关分析和分子对接结果筛选脲酶抑制组分。结果表明,蒲公英根、叶、花的石油醚组分抑酶活性较低,其IC_(50)大于5 mg/m L;根、叶、花部位乙酸乙酯、正丁醇和水组分对JBU和HPU均具有抑制作用,花的乙酸乙酯组分抑制作用最强,对JBU和HPU的IC_(50)值分别为0.184±0.007和0.091±0.003 mg/m L。蒲公英中酚类化合物相对含量与脲酶活性相关系数分别为0.732和0.750,是蒲公英中主要脲酶抑制组分;结合分子对接结合能,确定绿原酸、咖啡酸、槲皮素和木犀草素为主要脲酶抑制组分。(3)酚类化合物对JBU抑制活性和抑制作用规律研究选取绿原酸、咖啡酸、槲皮素和木犀草素,采用紫外分光光度法、荧光光谱法、等温滴定量热(ITC)、表面等离子共振(SPR)等方法确定其与JBU的抑制类型、抑制率、猝灭反应特性、结合热力学、动力学参数。结果表明绿原酸、咖啡酸、槲皮素和木犀草素对JBU的抑制作用属于非竞争性抑制类型,抑制IC_(50)值为57.24±1.91、21.47±2.66、35.67±1.01、26.07±4.83μM,作用位点均为flap区。荧光光Inhalation toxicology谱结果表明酚类化合物对脲酶的结合为静态猝灭,结合位点数约为1,猝灭常数K值分别为1.05×10~7、6.76×10~7、1.62×10~7和1.29×10~7 L/mol。ITC实验表明酚类化合物的结合常数Ka分别为4.15×10~4,7.20×10~4,4.52×10~4和1.64×10~4 L/mol,脲酶抑制活性较高;与JBU作用的ΔG<0,说明其结合反应具有自发性。咖啡酸和槲皮素结合脲酶的焓变项ΔH<0和熵变ΔS>0,说明其是焓变和熵变双驱动;绿原酸和木犀草素焓变项ΔH<0而熵变ΔS<0的,说明其是焓变是其反应的主要驱动力。SPR试验结果表明酚类化合物的结合平衡常数K_A值在10~3和10~4之间,表现出中等强度的亲和能力,绿原酸与脲酶的结合速率较快,能够快速进入到活性中心,有效抑制脲酶的活性。不同酚类组合为以叠加作用为主。(4)酚类化合物对HPU抑制活性和抑制作用规律研究选取绿原酸、咖啡酸、槲皮素和木犀草素,采用紫外分光光度法、荧光光谱法、ITC、SPR等方法确定绿原酸、咖啡酸、槲皮素和木犀草素的HPU抑制类型、抑制率、猝灭反应特性、结合热力学、动力学参数。结果表明绿原酸、咖啡酸、槲皮素和木犀草素对HPU的抑制作用属于混合型竞争性抑制类型,同时作用于Flap区和Ni~(2+)活性中心;IC_(50)值分别为36.37±3.34、16.63±0.83、38.94±0.86和18.75±0.91μM。荧光猝灭结果表明酚类化合物对脲酶的结合为静态猝灭,结合位点数约为1,猝灭常数K值分别为2.19×10~7、4.47×10~7、1.82×10~7和3.89×10~7L/mol。ITC结果表明酚类化合物与脲酶的结合ΔG<0,为自发的放热反应,且为熵变和焓变双驱动;结合常数分别为1.26×10~4,1.82×10~4,1.48×10~4和9.90×10~4L/mol。SPR试验结果表明酚类化合物与脲酶结合方式为快结合快解离模式,平衡常数K_A值在10~4数量级,具有较强的亲和能力。协同抑制试验结果表明绿原酸-木犀草素组合、咖啡酸-木犀草素组合为协同作用,绿原酸-槲皮素、咖啡酸-槲皮素两个组合为协同或叠加作用,绿原酸-咖啡酸和槲皮素-木犀草素组合为叠加作用。(5)酚类组合对幽门螺杆菌感染胃炎小鼠的的保护作用选取协同抑制作用最好的咖啡酸-木犀草素组合,测定其对幽门螺杆菌的抑制能力、清除作用、胃黏膜的保护作用、Ig G抗体水平、炎症因子分泌量的影响。结果表明,酚类化合物对幽门螺杆菌的MIC值分别为64、128、128和256μg/m L,花乙酸乙酯的MIC为256μg/m L,酚类化合物都对幽门螺杆菌具有抑制活性。花乙酸乙酯组表现出较好的幽门螺杆菌体内清除效果;咖啡酸-木犀草素组合对幽门螺杆菌清除效果与阳性药相当。花乙酸乙酯和酚类组合显著促进胃黏膜组织修复,减少胃黏膜上皮组织损伤;Ig G抗体水平分别降低50.19%、32.04%、48.95%和45.33%,炎症因子TNF-α和IL-6的含量分别减少23.19%、32.34%、33.88和35.20%和23.3%、27.60%、27.80%和27.91%;酚类组合对胃炎的保护作用显著。(6)酚类组合对脲酶抑制作用机理初探采用单分子对接、多分子对接、分子动力学模拟等方法分析脲酶结合口袋、酚类结合空间结构,结合稳定性、结合能、氢键数量等相互作用参数,探索多酚协同抑制脲酶的作用机制。结果表明JVorinostat价格BU和HPU空间结构高度一致,但JBU结合口袋大于HPU;酚类化合物结合均会引起脲酶Flap区域结构变化,结合位点空间收缩;酚类与JBU结合时氢键数为2-4个,结合能在150-350 KJ/mol,与HPU结合时氢键数为1-5个,结合能在150-350KJ/mol。多分子对接结果表明JBU结合口袋仅能容纳一个分子,另一个结合在脲酶的其他结构域,宏观表现出抑制作用的叠加;HPU结合口袋较小,两个酚类化合物以空间位阻最小的结构进入并稳定结合在催化区,宏观表现出抑制活性的协同作用。