黄素单核苷酸(FMN)是核黄素的活性形式之一,是一些辅酶、玫瑰黄素等的生物合成前体,这些辅酶在多种关键的生理功能中发挥着重要的作用。近年来,由于FMN在生命活动与健康方面的重要价值,其被广泛运用于医药、食品加工、饲料等领域中。本研究以野生型枯草芽孢杆菌来源的双功能核黄素激酶基因ribC为原始基因,构建了一系列合成生物学工具和高通量筛选方法,运用生物信息学手段进行分析,以提高FMN产量。主要研究结果如下:(1)构建了响应FMN浓度变化的生物传感器。首先对来源于枯草芽孢杆菌的潜在的FMN核糖开关进行分析,利用核黄素操纵子5’-UTR能够受到FMN浓度变化影响从而改变自身构象的特性,以红色荧光蛋白Mcherry为报告基因,在p确认细节 ET28a上以FG-4592 MWP_(tac)为启动子构建了生物传感器,并对该传感器在0 n M-100 n M的不同浓度梯度核黄素与FMN影响下的功能性质进行了实验验证。结果表明,构建的FMN生物传感器在预定浓度范围内,特异性受到FMN浓度的影响,FMN浓度越高荧光强度越弱,同时不受核黄素的干扰。(2)优化了FMN核糖开关。运用PYMOL等软件分析FMN核糖开关的结构,对核糖开关适配体与FMN非共价结合的位点进行研究,对潜在的关键区域J6/1设计了饱和突变,通过反向PCR构建了FMN生物传感器的饱和突变文库,利用流式细胞技术和多功能酶标仪进行高通量筛选。最终相较于野生型,突变株G5荧光范围提高了127%。(3)ribC的体内持续进化与突变体的高通量筛选。利用已有的基于T7RNA聚合酶和胞苷脱氨酶的碱基编辑系统,与承载了生物传感器和靶基因ribC的系统在宿主细胞中共表达,实现对ribC基因的持续进化。随后使用流式细胞技术,对不Medical face shields同荧光强度的细胞进行分选,得到ribC的进化文库。(4)核黄素激酶的动力学分析。运用GROMACS和Swiss model等分子建模软件,对野生型和5H3突变株核黄素激酶进行分子动力学模拟,分析了它们结构上的差异以及可能的酶活提高的原因。同时通过SDS-PAGE分析,检测到各株突变株目的蛋白的表达,并检测了各株突变株的酶活,以验证该系统筛选出来的突变株酶活与野生型相比有所提高。(5)全细胞催化生产FMN。最终对突变株进行了全细胞催化实验,在10 m L的转化体系中,5H3突变株FMN的最高产量达到43.7 mg·L~(-1),摩尔转化率达到18.3%,其提高至出发菌株的7.86倍。