β-淀粉样蛋白(Aβ),主要是具有42个氨基酸的Aβ(Aβ42),在大脑内的聚集和沉积是阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease,AD)发病机理中的一个关键因素。目前临床上治疗AD的药物或技术只能缓解症状或疗效存在争议。因此,寻找到安全、有效的预防和治疗药物或技术成为了当务之急。早已证明,脑内的部分Aβ可通过多种途径转运至外周系统并被清除。因此,增加外周血液中Aβ的清除率,减少其在血液中的水平来降低其在脑内的沉积可能是治疗AD的一个途径。Aβ42聚集体,特别是Aβ42寡聚体,不仅损害神经细胞的功能,它们还以可溶状态或沉积在血管壁上损伤血管内皮细胞,进一步加重AD的病理。因此,减少或消除Aβ42聚集体对血管内皮细胞的影响也会成为预防和治疗AD的一个重要目标。纳豆激酶(Nattokinase,NK)(EC 3.4.21.62)是一种天然的蛋白水解酶,其安全性和溶栓作用已被广泛研究并已得到充分肯定。最近有研究提出,NK在生理条件下可能会缓慢降解Aβ42,显示了NK在预防或治疗与Aβ42相关疾病如AD中可能会发挥一定的作用。然而,有关NK在靶向结合和降解不同形式的Aβ42,尤其是Aβ42聚集体(具有神经毒性的Aβ42形式),以及降低和清除血液中甚至脑中Aβ42负荷等方面的研究目前还非常有限。鉴于目前尚无安全、有效的预防和治疗AD方法,系统开展NK对不同形式Aβ42聚集体的降解作用并揭示其对预防和治疗AD的生理意义的研究是非常有必要的。本论文在分子、细胞和动物水平上系统地研究了NK对Aβ42及其多种聚集体的靶向结合与降解作用、NK催化的Aβ42聚集体的降解对血管内皮细胞的保护作用,以及NK对血液和脑内Aβ水平或斑块负载的影响,旨在促进预防、治疗与Aβ42聚集体相关疾病如AD的药物的研究与开发。通过本论文的研究,取得如下主要的结果:1.NK在一定时间内捕获不同形式Aβ42(单体、寡聚体、纤维)的能力不同,其中对Aβ42寡聚体的捕获能力最强。进一步分析发现,NK与不同形式的Aβ42(单体、寡聚体、纤维)的结合既可能是非催化性的,也可能是催化性的。2.我们应用系列Aβ肽及其聚集体等为底物,测定NK的底物结合特异性。结果表明,NK对Aβ42或Aβ40及其聚集体的结合特异性最高,远高于C-端截短的Aβ肽如Aβ35(包括其聚集体),而且几乎不与Aβ28、Aβ9结合。由此推断,Aβ42/Aβ40的C-端区Gly29至Val40氨基酸残基肽段很可能是NK的特异性靶向的重要区域,而由该区域形成的特定整合构象应该是NK识别和结合的最有效的靶点。3.在确定了NK对Aβ42聚集体具有较高的结合效率的基础上,我们分析了NK与Aβ42单体、Aβ42寡聚体和Aβ42纤维孵育后底物的降解率与产物体系。结果表明:NK主要催化Aβ42的聚集体形式,而且NK降解Aβ42寡聚体的能力高于其降解Aβ42纤维的能力,同时得出,相比于较大的Aβ42聚集体,较小的Aβ42聚集体与NK相互作用可能更符合NK催化的要求,Aβ42链间特定的整合构象是NK对其发挥催化作用的结构基础,而这种整合构象更多地存在于Aβ42寡聚体中而非Aβ42纤维中,Aβ42单体中不存在。另一方面,NK对Aβ42或其聚集体的降解分别产生了亲水性N-端片段和疏水性C-端片段。这些亲水性的Aβ片段可能是具有28至35个氨基酸残基且总体呈亲水性的Aβ肽,而疏水性的Aβ片段可能主要与其它Aβ42链的C-端区聚集形成不完整的Aβ42聚集体或就地留在了剩余的底物Aβ42聚集体中。4.为了确定NK催化Aβ42聚集体中的链的裂解是否影响Aβ42聚集体的结构(构象)稳定性,我们测定了NK与三种不同形式Aβ42形式(单体、寡聚体、纤维)孵育过程中Aβ42的聚集程度。结果表明:NK催化的Aβ42聚集体的降解明显减缓或降低了Aβ42或其小聚集体的(进一步)聚集,并可能同时引起不完整的Aβ42聚集体的拆分(或解聚)。5.应用血管内皮细胞测定了NK催化的Aβ42聚集体的降解对细胞存活率和损伤率的影响。结果表明:Aβ42寡聚体和Aβ42纤维可剂量依赖地引起血管内皮细胞活力的下降,且等剂量的Aβ42寡聚体和Aβ42纤维对血管内皮细胞活力的负面影响程度相似,但NK催化Aβ42聚集体降解后显著减少甚至消除了Aβ42聚集体对血管内皮细胞活力(或存活)的不利影响。细胞损伤率的测定结果表明,Aβ42寡聚体和Aβ42纤维均可诱导血管内皮细胞的损伤或死亡,而NK的存在明显减轻了Aβ42聚集体对血管内皮细胞的损伤作用。由此得出,NK可通过催Undetectable genetic causes化Aβ42聚集体降解对血管内皮细胞的活性或存活率起到保护作用。6.我们分别通过细胞的划痕愈合和transwell迁移实验分析了Aβ42聚集体对HUVECs横向和径向迁移的影响。在划痕愈合实验(横向迁移)中,Aβ42寡聚体和Aβ42纤维均可引起HUVECs划痕融合的延迟,显示出对HUVECs迁移能力损伤作用,其中Aβ42纤维对靶细胞迁移的影响较Aβ42寡聚体更显著。然而,NK明显提高了靶细胞的迁移率。所以,NK催化的Aβ42聚集体,尤其是Aβ42纤维的降解,对血管内皮细胞的横向迁移能力有明显的保护作用。另一方面,transwell测定的细胞径向迁移结果表明,Aβ42聚集体几乎不影响靶细胞在三维空间是上的迁移能力,尽管NK的存在仍然有助于维持靶细胞的径向迁移。总之,Aβ42纤维比Aβ42寡聚体更能影响或阻碍血管内皮细胞的迁移能力,而NK的存在明显维护或保护了血管内皮细胞的迁移能力免受Aβ42聚集体,尤其是Aβ42纤维的影响。7.血管内皮细胞的致密性和屏障性能的调节还高度依赖于其黏附性。为此,我们分析了Aβ42聚集体对HUVECs黏附能力的影响。结果表明:Aβ42寡聚体和Aβ42纤维均可降低靶细胞的黏附率,而且Aβ42寡聚体比Aβ42纤维的损害作用更大。NK对Aβ42寡聚体和Aβ42纤维的降解显BIBW2992著减轻了这些Aβ42聚集体对靶细胞黏附率的影响,甚至可使因轻微受损Lorlatinib半抑制浓度而活性脱附的靶细胞的黏附能力(即再黏附率)得到一定的恢复。为了确定Aβ42聚集体对血管内皮细胞黏附率的影响是否与VE-cadherin有关,我们进一步分析了相应条件下HUVECs的VE-cadherin水平。结果表明,Aβ42聚集体均显著降低了HUVECs的VE-cadherin表达水平,NK对Aβ42聚集体的催化降解可在一定程度上减少Aβ42聚集体对VE-cadherin表达水平的影响,从而使细胞与细胞之间的黏附得以维持。进一步分析得出:Aβ42聚集体对VE-cadherin表达水平的影响可能是它们影响血管内皮细胞的黏附能力的部分机理。8.我们通过动物实验研究了NK对血液和脑内Aβ水平或斑块负载的影响。体外实验的结果表明:NK浓度依赖地降低了血清中Aβ的水平。进一步的体内实验结果证明,虽然NK会在被摄取和/或进入血液过程有部分丢失(被降解),但仍有少部分NK进入血液系统,并显示出良好的降解Aβ的作用。除此之外,本论文分析了AD小鼠大脑海马区细胞的(群体)形态和Aβ斑块的负荷。结果表明:虽然NK对小鼠大脑海马区细胞的(群体)形态影响不明显,但Aβ斑块的负荷有所减少。这说明,NK通过降低外周Aβ的水平可能在一定程度上间接促进了脑内Aβ的外流,从而可在一定程度上减轻大脑海马区的病理学改变。综合以上研究结果,我们得出:NK可降解Aβ42聚集体,阻抑Aβ42聚集体对血管内皮细胞多方面的损伤,进入体内后可有效降低血液中Aβ的水平,并可在一定程度上减少脑内Aβ斑块的负荷。本论文的研究结果为NK在预防和治疗AD的可行性提供了实验依据和一定的理论指导。