研究背景:缺血性脑卒中是一种由于各种脑血管病变所致脑部的血液供应障碍,继而局部脑组织缺血缺氧性坏死,然后迅速出现相应脑区神经功能缺损的临床综合症。目前,阿替普酶标准静脉溶栓治疗和血管内介入治疗是临床上缺血性脑卒中的主要疗法,两种疗法旨在恢复受损区域的血供,且均有特定的“时间窗”。虽然血流的恢复(再灌注)对于缺血脑组织的挽救非常重要,但是,血流恢复也会导致缺血组织再灌注损伤,缺血再灌注损伤与缺血性脑卒中的预后密切相关。因此,深入探索缺血再灌注的病理机制,寻找改善再灌注损伤的药物已经成为缺血性卒中研究的重中之重。线粒体对神经细胞的存活至关重要,在缺血性神经元死亡的病理生理中起着关键作用。其中,线粒体动力学对维持线粒体形态至关重要,以往多项研究表明,线粒体动力学在缺血再灌注损伤中出现障碍,导致线粒体碎片化,支离破碎的线粒体可导致能量破坏、氧化应激、ROS生成增多。这些病理变化随后导致线粒体膜电位受损以及线粒体促凋亡因子的释放,进一步激活线粒体依赖性细胞凋亡途径,最终导致细胞死亡,组织损伤。而OMA1是一种锌依赖性金属内肽酶,其位于线粒体内膜的,线粒体应激时可激活,作用于L-OPA1的S1位点。此外,L-OPA1还存在S2位点,i-AAA蛋白酶YME1L作用于该位点,YME1L是正常情况下OPA1加工所必需的。OPA1是一种位于线粒体内膜的GTP酶,参与线粒体内膜融合、线粒体DNA稳定、线粒体嵴结构的维持。研究表明,总OPA1的过表达可缓解神经元细胞凋亡和线粒体损伤。L-OPA1过表达可通过减少神经元凋亡和保留线粒体功能来保护缺血性大脑。但是OMA1对缺血再灌注损伤诱导的线粒体功能障碍和细胞凋亡的影响尚未研究。目的:研究以缺血性脑卒中细胞模型为着手Smoothened Agonist分子式点,探讨OMA1对OGDR处理medical student的SH-SY5Y细胞活性,凋亡的影响,并阐述OMA1是否通过调节线粒体功能从而影响细胞凋亡,进而寻找针对缺血性脑卒中的防治方法。方法:(1)在对缺血性脑卒中细胞模型的文献检索基础上,通过CCK8技术确定缺血性卒中的细胞模型的最佳处理时间。给予SH-SY5Y细胞不含FBS的无糖DMEM,然后置于低氧培养箱氧葡萄糖剥夺不同时间,随即换成完全培养基置于37℃,5%CO2恒温培养箱继续培养24小时,从而建立氧葡萄糖剥夺/再灌注(OGDR)模型。(2)通过Western Blot技术检测对照组和模型中OMA1及其相关蛋白OPA1和YEM1L的基础表达量(3)在SH-SY5Y细胞中,运用si-RNA技术敲低OMA1,并通过Western Blot和实时荧光定量PCR从蛋白表达和mRNA表达两个水平检测OMA1敲低的效果。(4)将实验分为对照组、OGDR组、OGDR+si-control组、si-OMA1组四组,并通过CCK8技术检测各处理组细胞活力,通过Annexin V-FITC细胞凋亡检测试细胞凋亡情况。(5)通过Western Blot检测线粒体融合分裂相关蛋白的表达,通过Mito tracker染色观察线粒体形态。(6)通过ATP检测试剂盒检测ATP含量、TMRM染色检测线粒体膜电位情况、DCFH-DA染色检测细胞内活性氧水平。(7)通过Western Blot技术进一步检测线粒体生成相关蛋白PGC1-α、NRF-1、TFAM的表达。结果:(1)氧葡萄糖剥夺/再灌注(OGDR)处理SH-SY5Y细胞促进OMA1显著激活。(2)抑制OMA1提高了细胞活力,ICI 46474细胞培养减少细胞凋亡,显著升高bcl-2的表达,并下调bax和cleaved caspase-3表达。(3)抑制OMA1增加L-OPA1的表达,减少线粒体碎片化。(4)抑制OMA1通过增强线粒体ATP含量,促进线粒体膜电位恢复,减少细胞内活性氧含量改善线粒体功能。(5)抑制OMA1改善了线粒体生成相关蛋白PGC1-α、TFAM 的表达。结论:氧葡萄糖剥夺/再灌注(OGDR)促进了 OMA1通路的激活,抑制OMA1通路可以提高细胞活力,减少细胞凋亡,这可能是通过改善线粒体形态及线粒体功能障碍,增加线粒体生成实现的。