新生血管的生成对肿瘤的生长和转移至关重要,可以为肿瘤的发生和发展提供营养物质。课题组在前期研究中筛选了一段多肽序列(ES2,IVRRADRAAVP),研究发现,该序列可显著抑制肿瘤新生血管的生成。基于前期研究结果,本课题将ES2作为研究对象,采用无抗凝活性的肝素(non-anticoagulant heparin,GSHP)对其进行化学修饰改善其存在的半衰期短、稳定性差等问题。为增加肿瘤靶向作用,首先采用与肿瘤细胞表面高表达的唾液酸具有高度亲和的苯硼酸作为靶向基团,利用3-氨基苯硼酸(3-aminophenylboronic acid,PBA)上的氨基与GSHP上羧基间的缩合反应将苯硼酸分子连接到糖链上,得到样品GSHP-PBA(GP)。其次,为增加纳米粒的成球能力,将维生素E琥珀酸酯(D-α-tocopherol succinate,TOS)以酯键的方式连接到寻找更多GSHP上,得到样品GSHP-PBA～TOS(GPT)。最后,通过胱胺(cystamine,Cys)作为连接臂将GSHP与ES2进行连接,得到样品ES2-GSHP-PBA～TOS(EGPT)。此外,为增加纳米粒的抗肿瘤活性,将广谱抗肿瘤药物紫杉醇(paclitaxel,PTX)包载在纳米粒内部,得到最终纳米粒PTX/EGPT NPs。PTX/EGPT NPs纳selected prebiotic library米粒具有“一药双靶”的作用,即在PBA的作用下,药物到达肿瘤部位,在肿瘤微环境(低pH、高GSH)刺激下,纳米粒解体,释放ES2和PTX,从而在抑制内皮细胞增殖的同时杀伤肿瘤细胞,达到抑瘤效果。本论文主要内容和取得结果如下:(1)PTX/EGPT NPs的合成与表征首先,采用高碘酸钠氧化和硼氢化钠还原的方法制备无抗凝活性的GSHP,采用EDCI和NHS作为催化剂将PBA通过酰胺键连接到糖链GSHP上,随后采用EDCI、NHS和DMAP作为催化剂将TOS通过酯键连接在糖链上。然后,以Cys为link将ES2连接到糖链上得到EGPT。每一步聚合物的结构通过1H NMR进行表征,最终表征结果显示成功制备了 EGPT。最后通过物理包载的方法将PTX包裹在纳米粒内部,得到PTX/EGPTNPs,采用高效液相色谱法(highperformance liquidchromatography,HPLC)研究PTX的载药量和包封率。采用动态光散射仪对纳米粒的粒径进行考察,通过透射电子显微观察纳米粒的形态,最后模拟肿瘤微环境对纳米粒的释药行为进行研究。结果表明PTX的载药量和包封率分别为4.39%±0.56%和70.11%±8.66%,纳米粒在水溶液中呈球形,粒径为202.32±4.32 nm。此外,PTX和ES2分别能在弱酸性环境和高谷胱甘肽环境下实现快速释放,表明纳米粒具有肿瘤微环境敏感的特性。(2)PTX/EGPTNPs的体外生物学评价以EAhy926细胞和B16F10细胞为研究对象,采用CCK-8、迁移、侵袭、管腔和凋亡实验评价PTX/EGPTNPs的体外抗新生血管生成和抗肿瘤能力,通过激光共聚焦和流式细胞仪研究PTX/EGPTNPs的体外肿瘤靶向性。结果表明,PTX/EGPTNPs能够显著性抑制两种细胞的增殖,抑制两种细胞的迁移和侵袭,并因有ES2的存在纳米粒能显著抑制内皮细胞的管腔形成。此外,结果发现PTX/EGPT NPs可以诱导内皮细胞和黑色素瘤细胞的调亡。通过靶向性实验研究发现,PTX/EGPTNPs与ES2相比,对黑色素瘤细胞具有更强的靶向性。(3)PTX/EGPTNPs的体内生物学评价采用小动物活体成像仪对PTX/EGPT NPs在小鼠体内的组织分布情况进行考察,采用荷瘤小鼠模型对纳米粒的体内抗肿瘤能力进行评价,且通过免疫组化实验研究了小鼠肿瘤组织中细胞凋亡因子和血管生长因子的表达。体内分布结果表明,纳米粒具有明显的肿瘤靶向性且能在肿瘤部位滞留更长时间。体内抗肿瘤实验结果表明,纳米粒在体内对实体瘤具有较强的抑制作用,抑制率能达到76.56%,且对小鼠并无明显的毒副作用。此外,免疫组化结果显示,纳米粒能够显著抑制Bcl-2、COX-2、MMP2/9、VEGF和TGF-β等因子的表达,显著促进Cyt-C和Caspases-3LGK-974研究购买的表达。综上所述,PTX/EGPTNPs表现出良好的抗新生血管生成活性和抗肿瘤活性。此外,本课题成功将肿瘤靶向剂、抗新生血管生成药物、抗肿瘤转移药物和化疗药物应用在同一药物递送系统中,具有较好的应用前景。