结直肠癌是威胁人类生命健康的恶性肿瘤之一,尤其是转移性结直肠癌,治疗手段有限,五年生存率低于20%。抗EGFR单克隆抗体疗法为转移性结直肠癌患者带来了曙光。西妥昔单抗是靶向EGFR的单克隆抗体药物。西妥昔单抗联合化疗为RAS/RAF野生型且肿瘤位于左侧的转移性结直肠癌患者的一线用药方案;西妥昔单抗联合RAF激酶抑制剂康奈非尼为BRAF V600E突变型转移性结直肠癌患者的二线用药方案。这些治疗方案有效延长了患者的生存期,提高了患者的生存质量。然而,越发频现的耐药问题严重限制了西妥昔单抗的临床应用,特别是EGFR胞外区获得性耐药点突变的产生使得西妥昔单抗完全失去结合活性,也失去了联合用药的可能。目前临床上缺乏相关用药指南和有效的解决策略。因此,研究EGFR胞外区点突变介导西妥昔单抗耐药的机制及解决耐药的策略具有非常重要的意义。基于此,本文开展了以下三方面的研究工作:(1)论文的第一部分工作中,研究通过在NIH/3T3细胞基础上构建稳定表达不同点突变EGFR(S492R,IChildhood infections491M,K489E,K467T,G465R,G465E,S464L,I462R,R451C,S442R,V441D)的细胞株,在细胞模型水平检测了西妥昔单抗对不同点突变EGFR结合活性的变化和对不同点突变EGFR磷酸化抑制作用的差异。进一步,研究通过制备不同点突变EGFR蛋白,在蛋白水平定量了西妥昔单抗对不同点突变EGFR的亲和力数值。最后,研究通过计算机同源模建,获得不同点突变EGFR的三维空间结构,阐述了不同点突变EGFR对西妥昔单抗耐药的潜在结构基础。这些研究结果为建立与EGFR胞外区点突变相关的临床用药指南提供依据,也为后续设计新一代药物奠定基础。(2)论文第二部分工作中,研究开发了一种结构指导和噬菌体辅助进化的方法用于西妥昔单抗定向进化从而逆转更多高频EGFR胞外区点突变S492R或G465R介导的耐药性。该方法首先基于EGFR与西妥昔单抗复合物的结构分析以及Rosetta软件计算预测,在西妥昔单抗的互补决定区中鉴定出与S492R或G465R突变相关的关键氨基酸残基,然后在这些氨基酸位点引入饱和随机突变构建一个展示西妥昔单抗突变体的噬菌体抗体展示文库,通过共筛选鉴定出对突变型EGFR和野生型EGFR都具有高亲和力的西妥昔单抗突变体(Ctx-VY,Ctx-Y104D和Ctx-W52D),最后通过一系列体内外实验验证了这些西妥昔单抗突变体可逆转EGFR胞外区点突变S492R或G465R介导的耐药性。(3)论文第三部分工作中,考虑到除了EGFR胞外区点突变介导西妥昔单抗耐药外,EGFR下游信号通路中如KRAS/BRAF突变也会导致西妥昔单抗耐药;此外,EGFR为肿瘤相关抗原,其在正常组织中也有表达,导致西妥昔单抗的肿瘤选择性不佳。确认细节因此,研究设计了一种可偏向性结合G465R突变型EGFR,并能克服多种耐药的T细胞衔接器Ctx-DD-TCB,从而提高抗EGFR疗法的肿瘤选择性和有效性。实验结果表明,Ctx-DD-TCB可在体外介导T细胞偏向性杀伤表达G465R突变型EGFR的结直肠癌细胞,同时Ctx-DD-TCB也可介导T细胞有效杀伤KRAS/BRAF突变型结直肠癌细胞;在免疫重建的NCG小鼠皮下移植瘤模型中,Ctx-DD-TCB对表达G465R突变型EGFR的结直肠癌细胞的体内抑瘤效果优于对表达野生型EGFR的结直肠癌细胞的体内抑瘤效果。