目的:本研究通过IL-4诱导U937细胞构建M2型巨噬细胞及建立哮喘小鼠模型,观察平喘颗粒对CFD、M2型巨噬细胞、自噬相关分子以及哮喘小鼠气道重塑的影响,探讨平喘颗粒对CFD介导的自噬-巨噬细胞M2型极化的调控机制与改善气道重塑机制。方法:实验一:采用LV3 CFD(基因干扰慢病毒)转染野生型239T细胞,用逐孔稀释法对慢病毒进行滴度测定并构建CFD-sh RNA。采用PMA诱导U937细胞分化为巨噬细胞,将巨噬细胞分为4组,分别为空白组、模型组、平喘颗粒组、CFD-sh RNA组。空白组正常培养,模型组与平喘颗粒组均用IL-4诱导构建M2型巨噬细胞模型,平喘颗粒组及CFD-sh RNA组则分别给予平喘颗粒含药血清和LV3-CFD(基因干扰慢病毒)溶液进行培养。干预72小时后,用Western blot法检测各组CFD蛋白及m RNA水平;加入第5组(CFD-sh RNA+CFD组),其余4组巨噬细胞提取及培养、细胞分组和干预方法同前,第5组(CFD-sh RNA+CFD组)与CFD-sh RNA组干预方法相同,并额外加入CFD重组蛋白进行干预。各组细胞干预72小时后,用Western blot、RT-q PCR以及流式细胞术分别检测各组Arg-1、FIZZ1、YM1蛋白和m RNA的表达水平及CD206阳性细胞百分比;用Western blot检测各组Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值、p62蛋白以及FB/C3b/C5b信号通路中相关蛋白的表达水平;巨噬细胞提取及培养方法同实验一,分为4组,分别为模型组、平喘颗粒组、雷帕霉素组、平喘颗粒+雷帕霉素组。4组均用IL-4诱导构建M2型巨噬细胞模型,模型组正常培养,平喘颗粒组及雷帕霉素组分别给予平喘颗粒含药血清和雷帕霉素(自噬激动剂)干预。平喘颗粒+雷帕霉素组则用平喘颗粒含药血清和雷帕霉素(自噬激动剂)共同干预。用Western blot及RT-q PCR检测各组CFD、Arg-1、FIZZ1、YM1的表达水平及CD206阳性细胞百分比;随后将除模型组以外其余3组的雷帕霉素(自噬激动剂)更换为3-MBaricitinibA(自噬抑制剂),并用Western blot及RT-q PCR检测各组CFD、Arg-1、FIZZ1、YM1的表达水平及CD206阳性细胞百分比;实验二:50只C57BL/6小鼠被随机分为5组,分别为空白组、模型组、平喘颗粒组、CFD-sh RNA组和平喘颗粒+CFD-sh RNA组,每组10只。除空白组以外,其余各组(模型组、平喘颗粒组、CFD-sh RNA组和平喘颗粒+CFD-sh RNA组)小鼠均以OVA致敏液行腹腔注射结合雾化激发手段建立小鼠哮喘模型。平喘颗粒组与平喘颗粒+CFD-sh RNA组于第15天至第20天给予1 m L平喘颗粒水溶液灌胃治疗(31.2 g/kg);空白组与模型组于第15天至第20天给予1m L蒸馏水灌胃;CFD-sh RNA组于第20天给予CFD-sh RNA慢病毒气道滴注。观察各组小鼠的一般状态、BALF中炎症细胞总数、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞数以及嗜酸性粒细胞数量;应用Mch激发试验检测各组哮喘小鼠气道高反应性;应用HE染色、PAS染色、Masson染色法观察各组哮喘小鼠肺组织病理形态学的变化;ELISA法检测各组BALF中血清IL-4、IL-5、IL-13以及OVA-Ig E水平;应用免疫组化法检测各组α-SMA蛋白表达水平;应用Western blot和RT-q PCR法检测各组Arg-1、FIZZ1、YM-1和CFD蛋白及m RNA的表达;Western blot法检测各组Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值、p62蛋白以及FB/C3b/C5b信号通路中相关蛋白的表达水平。结果:1.与空白组比较,模型组CFD蛋白及m RNA水平显著增加,差异均具有统计学意义Hedgehog/Smoothened抑制剂(P<0.05)。与模型组比较,平喘颗粒组与CFD-sh RNA组CFD蛋白与m RNA水平显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。其中平喘颗粒组CFD的表达与CFD-sh RNA组相当。2.Western blot及RT-q PCR结果显示,与空白组相比,模型组Arg-1、FIZZ1和YM1蛋白和m RNA的表达水平均显著增加,差异均具有统计学意义(P<0.05)。同时,流式细胞术结果表明,与空白组相比,模型组CD206阳性细胞百分比显著增加,差异均具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,平喘颗粒组与CFD-sh RNA组Arg-1、FIZZ1、YM1蛋白和m RNA的表达水平及CD206阳性细胞百分比均显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.05);CFD能够显著逆转由于CFD抑制导致的Arg-1、FIZZ1、YM1蛋白和m RNA的表达水平及CD206阳性细胞百分比的降低。然而与模型组相比,CFD-sh RNA+CFD组Arg-1、FIZZ1、YM1的表达水平及CD206阳性细胞百分比无显著性变化,差异均无统计学意义(P>0.05);模型组Beclin1与LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值较空白组显著增加,p62蛋白的表达水平显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,平喘颗粒组与CFD-sh RNA组Beclin1与LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值显著降低,p62蛋白的表达水平显著增加差异均具有统计学意义(P<0.05)。而在CFD-sh RNA稳转U937细胞中加入CFD重组蛋白后,自噬标记蛋白的表达水平与模型组比较无显著性变化,差异均无统计学意义(P>0.05)。3.雷帕霉素组Arg-1、FIZZ1、YM1的表达水平及CD206阳性细胞百分比较模型组显著增加,差异均具有统计学意义(P<0.05)。而平喘颗粒+雷帕霉素组Arg-1、FIZZ1、YM1的表达水平及CD206阳性细胞百分比显著高于平喘颗粒组,差异均具有统计学意义(P<0.05),显著低于雷帕霉素组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,雷帕霉素组CFD表达水平无明显变化,差异均无统计学意义(P>0.05)。平喘颗粒+雷帕霉素组CFD的表达水平与雷帕霉素组比较显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.05);Western blot及RT-q PCR结果显示3-MA组和平喘颗粒+3-MA组的Arg-1、FIZZ1、YM1的表达水平及CD206阳性细胞百分比较模型组显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。其中平喘颗粒+3-MA组Arg-1、FIZZ1、YM1的表达水平及CD206阳性细胞百分比显著低于3-MA组和平喘颗粒组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,3-MA组CFD表达水平无明显变化,差异均无统计学意义(P>0.05)。平喘颗粒+3-MA组CFD的表达水平与3-MA组比较显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。4.Western blot结果显示,与空白组相比,模型组FB的表达显著降低,而FB的剪切分子FBα的表达显著增加,差异均具有统计学意义(P<0.05),FB的剪切分子FBβ的表达略降低,差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组相比,平喘颗粒组与CFD-sh RNA组FB及其剪切分子FBβ的表达水平显著增加,FB的剪切分子FBα的表达显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。在CFD-sh RNA稳转U937细胞中加入CFD重组蛋白后,FB、FBα和FBβ蛋白的表达水平与模型组比较无显著性变化,差异均无统计学意义(P>0.05);此外,与空白组相比,模型组C3b和C5b的表达显著增加,差异均具有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,平喘颗粒组与CFD-sh RNA组C3b和C5b的表达水平显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。在CFD-sh RNA稳转U937细胞中加入CFD重组蛋白后,C3b和C5b蛋白的表达水平与模型组比较无显著性变化,差异均无统计学意义(P>0.05)。5.在应用Mch激发试验过程中,随着Mch浓度的增加,各组小鼠均出现张口呼吸、呼吸变慢及幅度加深等的情況,且随着药物浓度增加,Penh值较基础值均明显升高,尤其是当Mch浓度达到6.25g/L时,模型组哮喘小鼠模型呈现明显的气道高反应性。组间比较结果显示,与空白组比较,模型组Penh值明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。而药物干预均能明显改善哮喘小鼠的气道高反应性,平喘颗粒组和CFD-sh RNA组与模型组比较Penh值显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.05);其中与CFD-sh RNA组相比,平喘颗粒+CFD-sh RNA组Penh值明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05);与空白组相比,模型组BALF中炎症细胞总数、淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞的数量均明显增加,差异均具有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,平喘颗粒组和CFD-sh RNA组炎症细胞总数、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的数量均明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05),而对淋巴细胞和巨噬细胞的数量无明显影响,差异无统计学意义(P>0.05)。与CFD-sh RNA组相比,平喘颗粒+CFD-sh RNA组炎症细胞总数、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的数量均明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05),而对淋巴细胞和巨噬细胞的数量无明显影响,差异无统计学意义(P>0.05)。6.ELISA结果示:与空白组比较,模型组小鼠血清IL-4、IL-5、IL-13及OVA-Ig E的含量均显著增加,差异均具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,平喘颗粒组和CFD-sh RNA组小鼠血清IL-4、IL-5、IL-13及OVA-Ig E的含量均明显降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。与CFD-sh RNA组相比,平喘颗粒+CFD-sh RNA组小鼠血清IL-4、IL-5、IL-13及OVA-Ig E的含量均明显降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。7.HE染色结果显示:空白组小鼠肺组织无明显病理变化。而模型组小鼠支气管及血管外周均可见大量的炎症细胞浸润,肺泡局部区域包裹大量的炎性细胞;管腔显著狭窄。其中模型组小鼠气道炎症评分与空白组相比明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。而药物干预均能明显改善哮喘小鼠气道炎症细胞的浸润,其中平喘颗粒组和CFD-sh RNA组小鼠气道炎症评分与模型组相比明显降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。与CFD-sh RNA组相比,平喘颗粒+CFD-sh RNA组小鼠气道炎症评分明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。8.PAS染色结果显示:空白组小鼠气管及支气管处可见极少量的杯状细胞,气道内未有较明显的黏液分泌。模型组小鼠气道可见较多的杯状细胞增生,形成大量黏液栓,其中PAS评分与空白组相比显著上升,差异具有统计学意义(P<0.05)。而药物干预均能明显改善杯状细胞的增生,与模型组比较,平喘颗粒组和CFD-sh RNA组小鼠PAS评分均明显降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。与CFD-sh RNA组相比,平喘颗粒+CFD-sh RNA组小鼠PAS评分明显降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。9.Masson染色结果显示,空白组小鼠气道周围可见极少量胶原染色,而模型组小鼠气道周围可见大量胶原染色。与空白组比较,模型组小鼠胶原染色面积显著增加,差异均具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,平喘颗粒组和CFD-sh RNA组小鼠气道周围胶原染色面积均明显降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。与CFD-sh RNA组相比,平喘颗粒+CFD-sh RNA组小鼠气道周围胶原染色面积明显降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。10.免疫组化染色结果显示,空白组小鼠气道可见极少量α-SMA蛋白阳性染色,而模型组小鼠气道周围可见大量α-SMA蛋白阳性染色。与空白组比较,模型组小鼠α-SMA蛋白的平均光密度值显著增加,差异均具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,平喘颗粒组和CFD-sh RNA组小鼠气道α-SMA蛋白的平均光密度值均明显降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。与CFD-sh RNA组相比,平喘颗粒+CFD-sh RNA组小鼠气道α-SMA蛋白的平均光密度值明显降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。11.流式细胞结果显示,与空白组比较,模型组小鼠CD86和CD206阳性细胞的百分比均显著增加,而CD86与CD206的比值显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,平喘颗粒组和CFD-sh RNA组CD86和CD206阳性细胞的百分比均明显降低,而CD86与CD20Biocompatible composite6的比值显著增加,差异均具有统计学意义(P<0.05)。与CFD-sh RNA组相比,平喘颗粒+CFD-sh RNA组小鼠CD86和CD206阳性细胞的百分比均明显降低,而CD86与CD206的比值明显增加,差异均具有统计学意义(P<0.05);Western blot和RT-q PCR法检测结果显示与空白组比较,模型组小鼠肺组织中Arg-1、FIZZ1、YM-1和CFD蛋白及m RNA的表达均显著增加,差异均具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,平喘颗粒组和CFD-sh RNA组小鼠肺组织中Arg-1、FIZZ1、YM-1和CFD蛋白及m RNA的表达均明显降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。与CFD-sh RNA组相比,平喘颗粒+CFD-sh RNA组小鼠肺组织中Arg-1、FIZZ1、YM-1和CFD蛋白及m RNA的表达均明显降低,差异均具有统计学意义(P<0.05);Western blot结果显示,模型组Beclin1与LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值较空白组显著增加,p62蛋白的表达水平显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,平喘颗粒组与CFD-sh RNA组Beclin1与LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值显著降低,p62蛋白的表达水平显著增加差异均具有统计学意义(P<0.05)。而在CFD-sh RNA稳转U937细胞中加入CFD重组蛋白后,自噬标记蛋白的表达水平与模型组比较无显著性变化,差异均无统计学意义(P>0.05);与空白组相比,模型组FB的表达显著降低,而FB的剪切分子FBα的表达显著增加,差异均具有统计学意义(P<0.05),FB的剪切分子FBβ的表达略降低,差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组相比,平喘颗粒组与CFD-sh RNA组FB及其剪切分子FBβ的表达水平显著增加,FB的剪切分子FBα的表达显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。在CFD-sh RNA稳转U937细胞中加入CFD重组蛋白后,FB、FBα和FBβ蛋白的表达水平与模型组比较无显著性变化,差异均无统计学意义(P>0.05)。此外,与空白组相比,模型组C3b和C5b的表达显著增加,差异均具有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,平喘颗粒组与CFD-sh RNA组C3b和C5b的表达水平显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。在CFD-sh RNA稳转U937细胞中加入CFD重组蛋白后,C3b和C5b蛋白的表达水平与模型组比较无显著性变化,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:1.平喘颗粒可以通过下调FBα、C3b和C5b蛋白的表达水平进一步降低CFD蛋白的表达;还可以降低M2型巨噬细胞标记蛋白Arg-1、FIZZ1、YM-1及m RNA的表达水平;2.平喘颗粒可以降低自噬相关分子Beclin1与LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达水平,增加p62蛋白的表达水平。3.平喘颗粒能够减轻哮喘小鼠气道高反应性、气道炎性细胞浸润、平滑肌层增厚、黏液分泌增多、杯状细胞增生、气道胶原沉积的病理变化。4.平喘颗粒可以降低哮喘小鼠血清及BALF中IL-4、IL-5、IL-13及OVA-Ig E的水平;可以下调α-SMA蛋白表达;可以降低哮喘小鼠肺组织中M2型巨噬细胞标记蛋白Arg-1、FIZZ1、YM-1及m RNA以及自噬相关分子Beclin1与LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达水平,增加p62蛋白的表达水平;还可以降低FBα、C3b和C5b蛋白的表达水平。5.平喘颗粒主要是通过CFD的表达,抑制FB/C3b/C5b信号通路激活,从而抑制巨噬细胞的自噬水平,进而抑制巨噬细胞的M2极化,抑制哮喘气道炎症和气道重塑,尤其是气道重塑。