【背景】马尔尼菲篮状菌病(Talaromycosis,TSM)是由马尔尼菲篮状菌(Talaromyces marneffei,TM)引起的一种严重侵袭性真菌病,散发于东南亚国家及中国南部省份。上世纪年代以来随着艾滋病发病率的增高,感染率也逐年上升,TSM已成为目前艾滋病临床诊断指征。然而,越来越多的研究表明,非艾滋病TSM的发病率逐年显著上升,其流行区域不断扩大,与艾滋病宿主TSM相比,其临床表现复杂且缺乏特异性。巨噬细胞(Macrophage,Mac)在抵御TM的免疫反应中起关键作用,且单核-巨噬细胞系统是TM入侵机体的主要场所。在TM入侵机体后,宿主体内的Mac可通过模式识别受体对其进行识别、吞噬及抗原呈递,这是诱导适应性免疫应答及清除病原体的关键步骤。因此,研究及阐明TM在机体内如何被巨噬细胞清除的机制,对临床找到潜在新的治疗方法,提高临床疗效有重要意义。β-葡聚糖是一种免疫调节剂,通过驱动巨噬细胞的免疫效应抗感染,这种现象持续数周至数月。真菌和酵母细胞壁中的β-葡聚糖引起巨噬细胞NADPH氧化酶复合物的磷酸化,最终产生ROS(例如超氧阴离子),发生氧化爆发反应。β-葡聚糖在一定浓度范围内能够明显地刺激巨噬细胞发生增殖,还能明显增加细胞内游离钙和c AMP。LC3相关吞噬(LC3-associated phagocytosis,LAP)是一种宿主细胞吞噬和降解病原体的高效途径,在清除沙门氏菌、结核分枝杆菌、曲霉、白色念珠菌等病原微生物感染中具有重要作用。β-葡聚糖激活LC3相关吞噬作用,通过Dectin-1识别吞噬细胞上含β-葡聚糖的颗粒会触发吞噬作用、活性氧的产生和LC3的募集。LC3募集增强了吞噬体成熟。因此,研究及阐明β-葡聚糖调节巨噬细胞的LC3相关吞噬作用具有理论基础。【目的】1.阐明TM的β-葡聚糖表达水平与TSM疾病严重程度的相关性。2.阐明TM的β-葡聚糖对巨噬细胞吞噬及清除TM功能影响及机制。【方法】1.β-葡聚糖的表达水平与TSM患者临床预后的相关性研究:收集TSM患者的临床信息(G试验结果、临床预后)与临床TM致病菌株β-葡聚糖的表达水平,通过转录组学及q RT-PCR检测及分析患者TM菌株β-葡聚糖基因(FKSP和RHO1)的表达水平后;结合以上结果将临床TM致病菌株分为G阳性(TM~(G+))及G阴性(TM~(G-))菌株。2.TM的β-葡聚糖表达差异与β-葡聚糖介导Mac吞噬及清除TM的功能研究:单细胞测序检测非艾滋病TSM患者及健康人PBMC细胞亚群比例;THP-1分化的巨噬细胞与TM标准株及β-葡聚糖酶洗脱TM标准株酵母相共培养,利用激光共聚焦显微镜和透射电镜下观察Mac吞噬TM的情况;TM和Mac共培养后接种观察各组TM的菌载量。3.β-葡聚糖介导Mac吞噬及清除TM的机制研究:单细胞测序检测及分析TM~(G+)菌株感染、TM~(G-)菌株感染TSM患者及健康人群外周血中巨噬细胞Dectin-1、LC3、Rubicon、ATF6、CEBP-β、DAPK1、LAP通路等关键分子的表达水平及差异;利用β-葡聚糖酶建立β-葡聚糖洗脱的TM菌株模型,通过细胞体外实验,研究β-葡聚糖对Mac表面Dectin-1受体及LAP通路关键分子表达水平、Mac对TM吞噬及清除等功能的影响;巨噬细胞与表达不同β-葡聚糖水平的TM共培养后,通过q RT-PCR及Western blot检测巨噬细胞Dectin-1、LC3II/LC3I、Rubicon、LAP通路(ATF6、CEBP-β、DAPK1)等关键分子的表达水平及差异。【结果】1.TSM患者的临床预后与对应TM菌株表达β-葡聚糖的水平密切相关:(1)转录组学发现酵母相(致病相)TM,β-葡聚糖基因(RHO1和FKSP)在G试验阴性的TM临床菌株中其表达水平显著低于G试验阳性TM临床菌株;(2)q RT-PCR验证并证实临床G试验阳性TSM患者对应的菌株其β-葡聚糖(RHO1)m RNA水平显著高于G试验阴性TSM患者菌株(P<0.05);(3)G试验阳性患者预后优于G试验阴性患者,主要体现在其持续感染率(9.7%)及死亡率(6.5%)显著低于G试验阴性组(18.4%,10.2%)(P<0.05)。2.Mac参与TM的吞噬及清除,且是机体防御TM的重要免疫细胞:人外周血PBMC单细胞测序结果提示:非艾滋病TSM患者的Mac比例及绝对值显著高于健康人,证实Mac在机体防御TM中起重要作用。3.Mac吞噬及清除TM的差异与TM表达β-葡聚糖差异密切相关:(1)透射电镜下观察发现临床TM~(G+)菌株与Mac巨噬细胞共培养4小时后可见Mac内单层膜囊泡形成及吞噬的TM,24小时后囊泡内TM被基本清除且数量明显减少,而临床TM~(G-)菌株与Mac巨噬细胞共培养4小时后虽Mac胞内可见吞噬的TM,但未见单层膜囊泡,且24小时后细胞内TM大量繁殖;(2)37℃下,利用β-葡聚糖酶建立β-葡聚糖洗脱的TM标准菌株后,发现与未洗脱组比较,β-葡聚糖酶洗脱组的TM菌株其β-葡聚糖表达水平明显下降(P<0.05);(3)分别建立β-葡聚糖酶洗脱前后TM菌株与THP-1共培养体系后,观察Mac吞噬及清除TM的能力,发AG-221溶解度现与未洗脱组比较,Mac对β-葡聚糖酶洗脱的TM吞噬能力明显下降(P<0.05),而其TM菌株的菌载量显著高于未洗脱组(P<0.05),提示TM菌株β-葡聚糖的LBH589临床试验含量降低可显著减弱Mac对TM的吞噬及清除功能。4.β-葡聚糖可能通过激活ATF6/CEBP-β/DAPK1通路,上调Mac的LAP对TM的吞噬及清除:(1)对非艾滋病G试验阳性TSM患者、G试验阴性TSM患者、健康人的PBMC进行单细胞测序及分析发现,G试验阳性TSM患者巨噬细胞中的CLEC7A(Dectin-1)、ATF6、CEBP-β、DAPK1、MAPLC3A(LC3)、RUBCN(Rubicon)的表达量显著高于健康人及G试验阴性TSM患者;(2)免疫荧光显微镜下观察Mac分别与G试验阳性及阴性TM菌株共培养4小时及24小时后发现,TM~(G+)组4小时可见LC3的荧光表达,24小时后其荧光强度明显增强,TM~(G-)组4小时、24小时均未见明显LC3荧光表达;(3)分别建立β-葡聚糖酶洗脱前后TM菌株与THP-1共培养体系后,发现与未洗脱组比较,β-葡聚糖未洗脱组的Dectin-1、LC3、CEBP-β、DAPK1的m RNA及蛋白水平显著增高(P<0.05)。【结论】TSM患者的临床预后及TM被Mac差异性清除的分子机制与β-葡聚糖表达及LAP激活的水平密切相关,其具体分子机制可能与β-葡聚糖激活ATF6/Clactoferrin bioavailabilityEBP-β/DAPK1通路,上调Mac的LAP对TM的吞噬及清除有关。