为了满足高产奶牛的能量需求,奶牛养殖中经常会在日粮中添加谷物和油脂。这种饲养模式增加了奶牛低乳脂综合症(Milk fat depression,MFD)的发病率,对奶业生产造成经济损失。共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid,CLA)是一种含有共轭双键的多不饱和脂肪酸。研究发现CLA能够抑制奶牛乳腺脂肪的合成,引起奶牛产生MFD。外泌体是指不同类型细胞分泌的功能性囊泡。已有研究发现外泌体在疾病诊断标志物和脂质代谢中发挥着重要的作用。因此,本研究利用CLA诱导奶牛生成MFD,提取分析乳外泌体中差异表达的miRNA,为乳外泌体miRNA在奶牛MFD中的应Tamoxifen IC50用提供基础数据。(1)奶牛试验:试验选取12头健康的荷斯坦泌乳奶牛,随机分为对照组和试验组,饲喂基础日粮的奶牛为对照组(Con组),饲喂基础日粮+400 g/d CLA的奶牛为试验组(CLA组),试验持续10 d,分别在第0、2、4、6、8、9STM2457、10 d采集牛乳进行奶牛乳产量及乳成分测定,对第10天采集的牛乳采用超速离心法提取外泌体并进行鉴定,使用高通量测序对牛乳外泌体的miRNA的表达谱进行分析,筛选差异miRNA。结果表明随着饲喂天数的增加,CLA对奶牛牛乳的乳产量、乳蛋白和乳糖含量没有显著影响,但乳脂肪含量呈现显著降低,表明CLA成功诱导奶牛形成MFD。通过透射电镜观察乳外泌体,发现呈现杯盘状,外泌体粒径分布在30～150 nm之间,蛋白质免疫印迹检测到外泌体标志蛋白TSG101和CD63,表明通过超速离心法成功提取到乳外泌体。对牛乳外泌体中miRNA进行高通量测序,一共测得46个差异miRNAs,其中显著上调的miRNA有13个,显著下调miRNA有33个。通过GO分析得出在lipid metabolic process中富集了291个候选靶基因,表明差异表达miRNAs有可能在脂质代谢过程中发挥作用。通过miRanda、Targetscan、PITA三个软件分别对显著差异的miRNA进行靶基因预测,筛选出miR-126-5p、miR-935、miR-2284c三个主要参与脂肪代谢的miRNA及其靶基因。(2)细胞试验:体外培养奶牛乳腺上皮细胞,转染筛选出的三个差异miRNA(miR-126-5p、miR-935、miR-2Medical care284c),RT-PCR检测miRNA在细胞中的表达量,结果表明三个miRNA均表达显著。分别构建靶基因启动子,与差异miRNA共转染细胞,双荧光素酶检测靶基因启动子活性,结果发现miR-126-5p显著抑制靶基因SCD的启动子活性,miR-935显著抑制靶基因PPARGC1A的启动子活性,miR-2284c对靶基因SREBF1启动子活性无显著影响。综上所述,本试验通过CLA处理奶牛,提取乳外泌体进行高通量测序,筛选出miR-126-5p、miR-935、miR-2284c三个参与MFD的miRNA。体外细胞实验证实miR-126-5p和miR-935能够抑制靶基因的启动子活性。这些结果为乳外泌体miRNA作为奶牛MFD诊断标记物打下基础。