肠道病毒A组71型(enterovirus group Atype 71,EV-A71)是引起婴幼儿手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)的主要病原体,属于肠道病毒属微小RNA病毒科。E V-A71感染常见于5岁以下的儿童,其症状多表现为发热以及在患儿的手、足和口等部位出现疱疹、溃疡等表征,对于病情进展迅速且严重的患儿,则有可能会影响神经系统,威胁到患者的生命安全,但该病至目前为止仍未有特效的治疗药物。EV-A71病毒的衣壳蛋白VP1是能够决定该病毒的抗原性的最重要的中和决定因子。VP1蛋白的基因序列具有能够与肠道病毒的血清型相对应的遗传特性,这也是可以根据不同血清型对肠道病毒进行分类的根据。VP1蛋白是EV-A71识别、吸附和结合靶细胞的关键位点。本实验室之前的研究表明EV-A71的结构蛋白VP1可以影响病毒的复制力,但是对VP1蛋白上关键氨基酸位点的精准定位并未进行更深入的研究。因此,通过比对EV-A71不同毒力表型株VP1蛋白的核苷酸序列,筛选合适的毒力候选位点,构建并拯救含有单个突变位点的新毒株,可以研究VP1蛋白上的关键氨基酸突变对病毒毒力的影响,并为进一步研究VP1蛋白在EV-A71致病机制中的作用提供基础。目的1.比较EV-A71的强毒株SDLY107和弱毒株SDJN2015-01的氨基酸序列在VP1片段上的差异,筛选毒力候选位点,构建并拯救突变型毒株。2.比较突变型毒株与亲本毒株在致细胞损伤力、复制力、细胞自噬、细胞凋亡和细胞感染效率等方面的差异,探究VP1蛋白上的关键氨基酸突变在EV-A71致病机制中的作用。方法1.以质粒pMD19T-SDLY107-EGFP为模板,利用重叠融合PCR和反向遗传学技术,得到含突变位点的重组质粒,后转染至BSR-T7/5细胞,拯救成功后得到突变型毒株,通过质粒双酶切和测序验证等对突变型毒株进行鉴定,空斑实验和CCID50测定病毒滴度。2.检测突变型毒株和亲本毒株在RD细胞和SH-SY5Y细胞中复制力、致细胞损伤力、细胞自噬、细胞凋亡和细胞感染效率等方面的差异。结果1.成功构建并拯救了突变型毒株SDLY-EGFP-107(VP1-1)和SDLY-EGFP-107(VP1-2),并对其病毒滴度进行了测定。2.RT-qPCR检测结果表明,突变型毒株SDLY-EGFP-107(VP1-1)和SDLY-EGFP-107(VP1-2)在RD细胞和SH-SY5Y细胞中的复制能力均弱于强毒株SDLY107。3.CCK-8、LDH实验检测到突变型毒株SDLY-EGFP-107(VP1-1)和SDLY-EGFP-107(VP1-2)在RD细胞和SH-SY5Y细胞中的致细胞损伤力均明显弱于强毒株SDLY107,且突变型毒株SDLY-EGFP-107(VP1-2)在RD细胞中的致细胞损伤力弱于 SDLY-EGFP-107(VP1-1)。4.Western Blot实验结果表明,突变型毒株SDLY-EGFP-107(VP1-1)和SDLY-EGFP-107(VP1-2)均能够诱导RD细胞发生自噬,但未能明显影响SH-SY5Y细胞中的自噬水平。5.流式细胞术检测结果表明,突变型毒株SDLY-EGFP-107(VP1-1)和SCH772984纯度SDLY-EGFP-107(VP1-www.selleck.cn/products/PD-03259012)诱导的细胞凋亡水平和细胞感染效率均弱于强毒株SDLY107,且突变株 SDLY-EGFP-107(VP1-2)对二者的影响弱于 SDLY-EGFP-107(VP1-1)。结论1.成功构建并拯救突变型毒株SDLY-EGFP-107(VP1-1)和SDLY-EGFP-107(VP1-2)。2.VP1蛋白的第146位和第147位氨基酸的分别突变均能减弱EV-A71感染导致的致细胞损伤力和复制力,影响EV-A71在神经细胞中的细胞自噬过程,且均能下调病毒感染后的细胞凋亡水平,降低EV-A71的细胞Medical diagnoses感染效率。3.VP1蛋白第147位氨基酸突变对病毒毒力的影响作用明显强于第146位氨基酸突变。