研究背景成红细胞转化特异性(E26 transformation specific,ETS)相关基因(ETS-related gene,ERG)是ETS家族中的一种转录因子,表达仅限于血管内皮细胞(Endothelialcells,ECs)、巨核细胞和软骨细胞,在内皮细胞中驱动与内皮谱系特异性相关基因的转录。GATA结合蛋白2(GATA Binding Protein 2,GATA2)是GATA转录因子家族的成员,在ECs中广泛表达,参与多种内皮特异性基因的调控。ECs排列在血管内层,参与血液与组织液之间营EPZ-6438半抑制浓度养物质和代谢废物的交换,感知循环环境变化并参与信号转导。同时ECs分泌多种内皮源性细胞因子,参与血管稳态的调节。ECs的稳态对于血管行使正常生理功能是不可或缺的。ECs在病理条件下被激活,导致ECs的稳态遭到破坏,进而造成血管功能障碍。ERG作为一种内皮细胞转录因子,参与内皮细胞多种生物学过程,在维持ECs稳态和血管稳定性中发挥不可或缺的作用,然而ERG基因本身的上游调控机制尚不清晰。基于ERG基因启动子区域含有多个GATA结合位点,我们在人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)中探究 GATA2 对 ERG 的调控作用及机制,以期为ECs的稳态和血管稳定性研究提供新的理论基础。研究目的探究转录因子GATA2在HUVECs中对ERG基因的调控作用及机制。研究方法1.在HUVECs中敲减GATA2,检测ERG mRNA和蛋白的表达水平合成GATA2小干扰RNA(GATA2 siRNA),将GATA2 siRNA与阴性对照小干扰RNA(Ctrl siRNA)用Lipofectamine 2000转染试剂分别转染至HUVECs中,48h后提取细胞总RNA和蛋白。使用RT-qPCR技术检测对照组和实验组GATA2和ERG mRNA表达水平。使用Western blot技术检测对照组和实验组GATA2和ERG蛋白表达水平。2.在HUVECs中过表达GATA2,检测ERG mRNA和蛋白的表达水平构建GATA2过表达质粒,将GATA2过表达质粒与阴性对照质粒(Con)用Lipofectamine 3000转染试剂分别转染至HUVECs中,48h后提取细胞总RNA和蛋白。使用RT-qPCR技术检测对照组和实验组GATA2和ERG mRNA表达水平。使用Western blot技术检测对照组和实验组GATA2和ERG蛋白表达水平。3.检测GATA2与ERG基因启动子区域结合情况经过生物信息学分析,选取ERG基因启动子区域-359和-1015 GATA结合位点,设计对应引物。利用染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)技术检测GATA2与ERG基因启动子区域-359和-1015 GATA结合位点的结合情况。4.验证GATA2在ERG基因启动子区域-359和-1015 GATA结合位点对ERG基因的调控作用以pGL3-basic为载体构建含ERG启动子野生型片段以及ERG启动子区域-359/-1015 GATA结合位点突变片段荧光素酶质粒。将荧光素酶质粒与GATA2 siRNA和GATA2过表达质粒分组共转染至HUVECs中,48h后提取细胞裂解物检测ERG基因启动子活性。研究结果1.将GATA2 siRNA和GATA2过表达质粒转染至HUVECs中,48h后提取细胞总RNA和蛋白,RT-qPCR和Western blot结果显示在GATA2 siRNA组中GATA2基因的mRNA和蛋白均显著性降低,在GATA2过表达组中GATA2基因的mRNA和蛋白均显著增高。2.将GATA2 siRNA和GATA2过表达质粒转染至HUVECs中,48h后提取细胞总RNA和蛋白,RT-qPCR和Western blot结果显示在GATA2 siRNA组中ERG基因的mRNA和蛋白均显著性降低,在GATA2过表达组中ERG基因的mRNA和蛋白均显著增高。3.ChIP实验结果显示GATA2与ERG基因启动子区域-359位点存在结合,GATA2与ERG基因启动子区域-1015位点无明显结合。4.一代测序(Sanger测序)结果显示我们成功构建出含ERG启动子野生型片段以及ERG启动子区域-359/-1015 GATA结合位点突变片段荧光素酶质粒。ERG启动子区域-359位点的碱基序列由AGCTAAGG突变为CTAGCCTT,Hospital Associated Infections (HAI)-1015位点的碱基序列由TGATTT 突变为 GTCGGG。5.双荧光素酶活性检测结果显示,在GATA2 siRNA组中,ERG基因的启动子活性显著降低;在GATA2过表达组中更多,ERG基因的启动子活性显著升高;ERG基因启动子区域-359位点突变后,GATA2对ERG基因启动子活性的调控作用消失;ERG基因启动子区域-1015位点突变后,GATA2对ERG基因启动子活性的调控作用依然存在。研究结论1.GATA2在HUVECs中对ERG基因具有正向调控作用。2.GATA2与ERG基因启动子区域结合。3.GATA2通过结合ERG基因启动子区域-359 GATA结合位点进而实现对ERG基因的正向调控作用。