糖苷酶(Glycoside hydrolases,GHs)可催化糖苷的水解或转苷反应,其催化转苷反应时不依赖磷酸化糖,因此可在体外实现糖苷的酶法合成。然而,大部分GHs同时催化水解和转苷反应,由于水解反应的存在,糖苷产物得率普遍不高。因此,研究GHs的水解和转苷反应的选择性机制,实现定向转苷,对糖苷合成具有重要意义。此外,因为糖苷键的类型对糖的结构与功能起决定作用,GHs催化转苷反应时的糖苷键类型的选择性,亦是糖苷合成的重要研究内容。GHs催化水解或转苷反应时会生成一种糖-酶结合过渡态(TS)结构,该结构的自由能垒高低可决定GHs水解/转苷的偏好性,然而TS结构难以通过实验捕获,TS结构的确定是GHs水解/转苷机制研究的难点和关键点。多尺度理论模拟可对GHs催化反应机理进行建模从而获得关键TS结构。α-糖苷酶在食品加工领域应用广泛,但目前的机制研究主要集中在β-糖苷酶,对α-糖苷酶的机理研究较少。本论文采用多尺度理论模拟方法对α-糖苷酶中有代表性的GH29家族的Lactobacillu此网站s casei来源岩藻糖苷酶Alf C的水解偏好性机理、GH77家族Thermus aquaticus来源的淀粉麦芽糖酶Ta AM的转苷偏好性机理进行解析,在此基础上根据影响水解与转苷偏好性的关键位点分布特征,对蔗糖水解酶和淀粉蔗糖酶进行分子改造实现了的水解/转苷定向调控,并通过多尺度理论模拟对其选择性机制进行解析。此外,还对Limosilactobacillus reuteri 121来源的4,6-α-葡聚糖转移酶Lr Gtf B的转苷键型的偏好性机理进行解析。主要研究结果如下:(1)GH29家族岩藻糖苷酶Alf C的水解偏好性机理研究。针对酸碱催化剂构象未被正确定位的问题,采用加速分子动力学模拟对酸碱候选残基D242所在loop进行构象采样,确定D242为酸碱催化剂,并捕获其可催化构象。QM/MM元动力学模拟结果表明Alf C糖基化反应,水解反应和转苷反应的自由能垒分别为16.1 kcal·mol~(-1)、9.8 kcal·mol~(-1)和11.4 kcal·mol~(-1),故Alf C为水解偏好性GHs。此外,还确定了三者的构象路线分别为~1C_4→[~3H_4]~(?)→~1C_4、~3S_1/~3H_4→[~3H_4/E_4]~(?)→~1C_4和~3S_1/~3H_4→[E_4]~(?)→~1C_4。通过分析水解和转苷反应TS结构,发现转苷TS结构D242的羧基O_(δ2)原子与受体糖环的O5原子的距离比水解反应中更近,两者之间具有静电排斥作用,这是Alf C水解偏好性的关键因素,从而导致转苷反应自由能垒比水解反应的高。(2)GH77家族淀粉麦芽糖酶Ta AM转苷偏好性机理研究。针对糖链距离酸碱残基E340远,质子转移不清晰及后续催化的问题,提出由250s loop介导的构象开关模型。路径-元动力学模拟表明糖链存在与否会使250s loop分别处于关闭(C)和开放构象(O),且C构象比O构象的能量高4.0 kcal·mol~(-1)。250s loop处于C构象时可诱导糖链发生滑动,使糖苷氧原子靠近酸碱残基E340催化糖基化反应,总自由能垒为12.9 kcal·mol~(-1)。此外,250s loop在水解和转苷时分别处于部分关闭(PC)和C构象。QM/MM元动力学结果表明水解和转苷反应的自由能垒分别为18.0 kcal·mol~(-1)和9.0 kcal·mol~(-1)。因此,转苷的整体能垒比水解低5.1 kcal·mol~(-1),与转苷/水解比5000:1的实验结果一致。分析水解和转苷反应TS结构发现,由于转苷反应的250s loop处于C态,活性位点的堆积比较紧密,TS比较稳定;而水解反应的250s loop处于PC态,活性位点堆积比较松散,TS不稳定。因此构象动力学诱导的过渡态能量差异是Ta AM为转苷偏好性GHs的重要因素,这与250s loop周围残基突变导致歧化/水解比值降低的实验结果一致。(3)GH13家族蔗糖水解酶SHs和淀粉蔗糖酶ASs水解和转苷的定向调控。蔗糖水解酶SHs和淀粉蔗糖酶ASs是GH13家族中序列、结构相似的两类酶,分别偏好水解和转苷反应。根据揭示的GHs水解与转苷偏好性关键位点分布特征,通过序列比对和结构分析发现两种酶亲核残基D邻位存在保守的氨基酸S(位于SHs)和A(位于ASs)。在两类酶中分别选取Xanthomonas axonopodus来源的Xa SH、Caulobacter crescentus来源的Cc SH和Neisseria polysaccharea来源的Np AS、Deinococcus geothermalis来源的Dg AS进行定点突变研究。Xa SH_(S281A)和Cc SH_(S271A)的T/H(转苷/水解产物比)由野生型的0.05和0.07分别增加到1.4和1.11,Np AS_(A287S)和Dg AS_(A285S)的T/H比由野生型的8.80和7.13分别下降到0.15和0.20,动力学数据亦表明,Xa SH_(S281A)和Cc SH_(S271A)由野生型的水解偏好变为转苷偏好,Np AS_(A287S)和Dg AS_(A285S)由野生型的转苷偏好变为水解偏好,并得到了HPLC、HPAEC-PAD和~1H NMR等实验结果支持。(4)GH13家族蔗糖水解酶SHs和淀粉蔗糖酶ASs水解和转苷选择性机理研究。选取具有高分辨率结构的水解酶Xa SH、转苷酶Np AS及其突变体为研究对象。MD模拟结果表明www.selleck.cn/products/INCB18424Xa SH、Np AS_(A287S)的S与亲核试剂D之间具有氢键作用,可导致受体糖分子的位置偏移,使水分子更容易渗透到活性位点发生水解反应。此外,该氢键降低了亲核试剂的p K_a值,可促进糖苷键断裂。QM/MM元动力学模拟结果表明XaEnzyme Assays SH、Xa SH_(S281A)、Np AS、Np AS_(A287S)水解反应自由能垒分别为10.3、13.5、8.9和7.1 kcal·mol~(-1),转苷反应的自由能垒分别为20.3、9.6、8.2和9.6 kcal·mol~(-1),与实验结果一致。分析转苷TS结构发现,当存在氢键时,+1亚位点糖环构象偏移,与-1亚位点糖环产生空间位阻,转苷反应自由能垒高于水解反应;反之,不存在该氢键时,则不存在位阻效应。由氢键作用引发的位阻效应是ASs/SHs是转苷/水解偏好的关键因素。(5)GH70家族Lr Gtf B的α-1,6/α-1,4键型选择性机理研究。QM/MM元动力学模拟结果表明Lr Gtf B糖基化反应为12.2 kcal·mol~(-1);以异麦芽糖为受体时α-1,6和α-1,4转苷反应自由能垒分别为6.7 kcal·mol~(-1)和22.3 kcal·mol~(-1);以麦芽糖为受体时α-1,6和α-1,4转苷反应自由能垒分别为11.7 kcal·mol~(-1)和14.8 kcal·mol~(-1),故Lr Gtf B为α-1,6转苷反应偏好性GHs。此外,分析转苷TS结构发现,+1亚位点上方的loop B具有可塑性,可被α-1,6成键时+1亚位点糖单元定向诱导,导致loop B上的T920的疏水甲基朝向+1亚位点移动,进而稳定糖环构象,促进α-1,6转苷反应。而在α-1,4转苷反应时,由于K1128和+1亚位点糖单元之间的氢键作用限制了+1亚位点糖单元构象空间,导致+1与-1亚位点之间的糖单元间产生空间位阻,从而不利于α-1,4转苷反应。