食物过敏是过敏性流行病之一,仅次于哮喘病,影响着全球2%～4%的成人和儿童的健康和生命。八大类常见食物过敏原有大豆、花生、小麦、坚果、牛奶、鸡蛋、甲壳类、鱼类,其中水产品占据两类。作为广受青睐的甲壳类水产品,三疣梭子蟹与其他软体类、甲壳类动物存在较强的过敏原交叉反应,其中不耐热且不耐强酸的精氨酸激酶(AK)是主要过敏原之一。同时,作为一种糖蛋白,其致敏性的研究备受关注。引起食物过敏的物质大多是糖蛋白,为探究糖基化修饰对过敏蛋白致敏性和致敏程度的影响,本文在制备和纯化了梭子蟹AK的基础上,对AK结构进行鉴定,并利用生物信息学技术预测和体外实验验证的方法,从结构层面阐释了糖基化修饰对梭子蟹AK致敏性的影响,为梭子蟹及其他水产品的降敏研究提供了理论基础和数据支持。论文主要结论如下:1、从三疣梭子蟹蟹肉中分离获得梭子蟹精氨酸激酶(AK)粗提物,通过SDS-PAGE凝胶电泳发现分子量约为40 KDa的条带,与多篇研究发现的AK相似。为得到纯的过敏原AK,利用制备型电泳进一步分离纯化,为后续的蛋白鉴定、糖基化修饰以及AK致敏性的探究提供了高纯度的样品。经胶内酶切,利用蛋白质组学和液质联用技术鉴定到高覆盖率的精selleckchem S63845氨酸激酶,确认此纯化样品即为三疣梭子蟹过敏原AK。本文利用蛋白质组学方法和LC-MS/MS技术,从特征肽段出发鉴定得到梭子蟹过敏原AK,并对AK的糖基化修饰进行结构表征,为食物过敏原标签规范化提供了重要的基础数据。2、以三疣梭子蟹过敏原AK为研究对象,计算了AK的理化性质,预测了AK的抗原表selleck激酶抑制剂位。结果表明,与三疣梭子蟹AK具有高度序列同源性的是蓝蟹、中华绒螯蟹等节肢动物的AK;三疣梭子蟹AK的B细胞线性抗原表位为39～44、87～103、174～181、309～317、326～330,T细胞线性抗原表位为18～22、52～55、174～175、193～195、229～232、276～277、299～300、345～351,且三疣梭子蟹AK的_(174)Thr-Lys_(175)均出现在B细胞和T细胞抗原表位预测位点,推测174位苏氨酸、175位赖氨酸在免疫原性中起重要作用。利用SWISS-MODEL、Discovery Studio和ZDOCK SERVE进行同源建模和分子对接。c Dock对接结果表明,相较于其他抗过敏药物,梭子蟹AK与西替利嗪的对接互作结合能最高,预测其对由梭子蟹AK引起的食物过敏有更好的降敏效果。西替利嗪主要通过与AK上Arg、Glu和Thr贡献的氢键、离子键亲和结合,推测西替利嗪与AK的结合掩蔽了AK的B细胞线性抗原表位和构象表位,进而降低了致敏蛋白与免疫球蛋白结合的可能性,达到抗过敏的效果。肥大细胞(Mast cell,MC)是过敏的关键驱动因子之一,肥大细胞的相关G蛋白偶联受体可介导MC活化。ZDOCK对接结果显示,无糖基化AK主要通过Tyr134、Ser150、Gly165的氢键和Phe168、Phe186的π-π相互作用与Mrgprb2结合,激活肥大细胞,引发过敏反应。单个糖基化修饰增强了AK的致敏性,但与无糖基化相比并无显著性差异,推Biomacromolecular damage测糖基化修饰会增强AK的致敏性,糖链对AK致敏性的关键作用在于修饰位点,其次是糖基的数量和糖型结构。3、为探究糖基化对AK致敏程度的影响,利用P815肥大细胞脱颗粒实验的组胺释放量和β-氨基己糖苷酶释放量,验证AK致敏性机理的推测。结果表明,过度糖基化对AK致敏性的影响不确定,因而美拉德反应可能无法应用于消减梭子蟹AK致敏性;相较于去糖基化AK,仅去除N-糖链的AK表现出更强的致敏性,这与ZDOCK蛋白对接的结果相一致,猜测是N-糖链的去除暴露了与O-糖链息息相关的构象抗原表位和线性抗原表位;相较于天然AK,仅去除O-糖链的AK表现出更弱的致敏性,猜测是因为破坏了与O-糖链相关的构象抗原表位,以及N-糖链仍掩蔽线性抗原表位的结果。因而,得到了一个推测:O-糖链在构象抗原表位中起重要作用,N-糖链可能会掩蔽线性抗原表位,这给降低梭子蟹AK致敏性的研究提供了一个新思路。