研究背景:脑出血(iHepatocyte-specific genesntracerebral hemorrhage,ICH)是一种常见的脑血管疾病,极高的致死率和致残率使其成为了广大临床工作者所面临的巨大挑战。脑出血后病理进程复杂,神经细胞死亡被认为是脑出血后神经功能缺损的主要因素,但脑出血后神经元死亡的机制目前仍不完全明确,因此对神经元死亡形式及机制的阐明成为了脑出血临床前研究的重要方向。本文旨在明确NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4,Nox4)和转铁蛋白/转铁蛋白受体(Transferrin/Transferrin Receptor,TF/TfR)介导的氧化应激和铁过载在脑出血后神经元铁死亡中的作用及机制,并寻找相关的干预手段,以期减轻脑出血后神经元死亡并改善神经功能预后。研究方法:使用胶原酶注射法构建大鼠脑出血动物模型。Nox4特异性siRNA的体内转染用以敲低Nox4的表达水平、DFO用以抑制脑出血后的铁过载,此外铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1)被用来拯救神经元铁死亡,而氯化亚铁的侧脑室注射被用来诱导脑组织中过量的铁累积。神经功能评分和前肢放置实验用以评估神经功能缺损程度;采用免疫荧光、Western-blot等手段分析Nox4、TF/TfR、兴奋性氨基酸转运蛋白 3(Excitatory Amino Acid Transporter 3,EAAT3)等相关蛋白的表达情况;4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-HNE)等氧化损伤标志物的测定由免疫荧光或免疫组化完成;普鲁士蓝染色分析铁过载情况;焦油紫/快蓝染色评估神经元死亡和组织损伤情况;各类商品化试剂盒测定相关氧化还原产物的水平;透射电镜技术观察铁死亡特征性细胞数量和结构。研究结果:脑出血可以诱导明显的氧化应激和铁过载并导致神经元铁死亡的发生,而Nox4的上调带来的过量过氧化氢(hydrogen JAK/STAT抑制剂peroxide,H2O2)和TF/TfR激活诱导的神经元内铁累积可以介导脑出血后的氧化应激和铁过载的发生。根据芬顿反应原理,上述机制可以诱导脑出血后大量致死性活性氧族(reactiveoxygen species,RIpatasertib采购OS)的产生。此外,脑出血后星形胶质细胞源性谷胱甘肽合成水平上调,而神经元谷胱甘肽耗竭可能与初级脂质过氧化导致的EAAT3表达下调相关。EAAT3表达下调带来的还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)耗竭抑制了 GPX4的表达,这意味着神经元脂质过氧化物清除能力被抑制。上述所有病理进程最终导致了脂质过氧化物堆积造成的不可逆神经元铁死亡的发生。我们的研究发现Nox4的敲低和铁螯合剂DFO的应用可以有效抑制脑出血后的氧化应激和铁过载现象,此外上述干预手段可以抑制脂质过氧化水平并由此恢复EAAT3-GSH-GPX4信号轴的表达,进而挽救脑出血后的神经元铁死亡并改善相应的神经功能缺损症状。研究结论:本研究明确了脑出血后确实存在典型的神经元铁死亡现象,揭示了 Nox4和TF/TfR异常上调介导的氧化应激和铁过载是脑出血后神经元铁死亡的重要分子机制,并表明EAAT3表达下调诱导的GSH缺乏和GPX4抑制是神经元铁死亡的主要原因,而星形胶质细胞源性谷胱甘肽合成能力在脑出血后出现了一定程度的上调。此外,本研究提示Nox4-siRNA及铁螯合剂DFO的应用可以通过缓解氧化应激和铁过载的方式挽救神经元铁死亡并由此改善大鼠脑出血后的早期脑损伤和神经功能预后,侧面支持了相关抗氧化及铁螯合治疗手段及策略的研发必要,并提供了相应的治疗靶标。