黑枸杞(Lycium ruthenicum Murr.)是茄科枸杞属多年生灌木,广泛分布于青海、新疆和甘肃等沙漠盐碱地区,是西部地区重要的药用植物资源和经济作物。黑枸杞富含多酚、黄酮和花青素等多种次生代谢物,对人体抗氧化等具有显著效果。近年来黑枸杞果实化学成分和生物活性研究成为热点,研究表明黑枸杞分布区域生态环境差异很大,且不同产地黑枸杞果实在营养成分及含量上都有差异。通过比较不同产地黑枸杞组分差异,并揭示组分代谢差异产生RAD001 NMR的潜在机制,有利于黑枸杞品种改良及药用成分资源利用。此外,深入研究黑枸杞果实多糖、多酚等功能性组分的胃肠道吸收代谢模式及改善肠道健康的作用机制将有助于合理利用黑枸杞药用及保健价值。1.以青海、内蒙古、甘肃、宁夏、新疆5个产地的黑枸杞果实为研究对象,系统测定5个产地黑枸杞果实粗多糖理化性质,结果表明5产地黑枸杞粗多糖单糖组分相同,而青海黑枸杞中总糖含量(47.47±0.34%)最高。分析黑枸杞总多酚、总黄酮、总花色苷含量发现,青海黑枸杞总多酚(36.78±0.38 mg/g DW)及总黄酮含量(25.55±0.28 mg/g DW)高于它4个产地黑枸杞。评估比较5产地黑枸杞果实购买PLX5622粗多糖和粗多酚体外抗氧化能力,发现青海黑枸杞果实粗多酚的DPPH(IC50=0.062±0.013 mg/mL)、ABTS+(IC50=0.218±0.039mg/mL)自由基清除能力最强。结合H2O2氧化损伤的Raw264.7细胞模型评估5产地粗多酚的细胞抗氧化能力,发现青海黑枸杞果实粗多酚能显著缓解H2O2对Raw264.7细胞造成的增殖抑制、减少细胞凋亡及ROS产生、上调抗氧化酶基因表达,下调炎症因子基因表达。以上结果表明青海黑枸杞果实含有更多抗氧化活性成分。2.为进一步挖掘5产地黑枸杞果实的差异活性化学组biogas upgrading分,借助代谢组分析5产地黑枸杞果实代谢谱,发现5个产地黑枸杞果实共有197种差异代谢物,其中16种有机酸及其衍生物、16种碳水化合物、25种苯丙素、12种花青素、33种类黄酮、24种生物碱、6种萜烯、7种维生素及其衍生物、14种氨基酸及其衍生物、16种类固醇,黑枸杞代谢成分具有地区差异性。富集分析差异代谢物发现,青海黑枸杞果实中多种苯丙烷及黄酮类化合物含量显著高于其他4个产地,其中10个上调代谢物与黑枸杞抗氧化活性显著相关。体外验证结果表明10个代谢物可有效清除DPPH(IC50范围为6.237～0.001 mg/mL)和 ABTS+(IC50 范围为 0.048～0.001 mg/mL)自由基,其中山奈酚-3-O-芸香苷和槲皮素-3-O-芸香糖苷的两种自由基清除IC50=1 μg/mL,抗氧化活性最强。转录组分析表明,参与类黄酮、苯丙素和花青素生物合成的基因在青海黑枸杞果实中的表达水平显著高于其他产地的黑枸杞。结合枸杞基因组数据,鉴定LrFLS和LrCYP75B1是编码山奈酚-3-O-芸香糖苷和槲皮素-3-O-芸香糖苷合成的限速基因。RT-qPCR定量结果显示,LrFLS和LrCYP75B1在青海黑枸杞成熟期和着色期均处于较高表达水平,且比其他4产地表达量约高4倍。通过在黑枸杞叶片中过表达LrFLS和LrCYP75B1发现,过表达LrFLS和LrCYP75B1可增加黑枸杞叶片中山奈酚-3-O-芸香苷和槲皮素-3-O-芸香糖苷的3倍含量,并提高黑枸杞提取物的体外抗氧化活性。上述结果表明,青海黑枸杞富含黄酮类代谢物,其中山奈酚-3-O-芸香苷和槲皮素-3-O-芸香糖苷两种黄酮物质的合成积累是青海黑枸杞高抗氧化活性的重要原因。3.为解析青海黑枸杞果实中山奈酚-3-O-芸香苷和槲皮素-3-O-芸香糖苷的生物合成转录调控机制,利用黑枸杞不同发育时期转录组数据,构建黑枸杞中2个代谢物合成基因的调控网络。借助ChIp-qPCR、酵母单杂、LUC和EMSA等技术确定LrMYB94和LrWRKY32分别通过直接结合LrFLS和LrCYP75B1的启动子来激活黑枸杞中山奈酚-3-O-芸香糖苷和槲皮素-3-O-芸香糖苷的合成。通过构建稳定过表达LrMYB94或LrWRKY32的黑枸杞愈伤组织,发现过表达LrMYB94或LrWRKY32可激活LrFLS和LrCYP75B1的表达,提高山奈酚-3-O-芸香苷和槲皮素-3-O-芸香糖苷含量,最终增强黑枸杞抗氧化活性。以上结果揭示了青海黑枸杞果实中关键抗氧化活性成分的转录合成调控机制。4.为了研究青海黑枸杞功能性组分(粗多糖、多酚、花色苷)在人体的消化吸收特征,构建体外胃肠道消化模型。结果表明黑枸杞果实多糖在胃肠消化后还原性糖从0.396±0.056 mg/mL增加为0.626±0.032 mg/mL,在多糖消化过程中未检测出游离单糖;果实多酚在胃肠消化后总多酚含量分别降低19.96%和21.01%,总黄酮分别降低16.60%和33.02%,且多酚粗提物代谢成分发生显著变化,胃肠消化后代谢物与肠道慢性疾病相关。通过大孔树脂纯化粗多酚,得到主要含有4种矮牵牛素和1种锦葵色素衍生物的纯化花色苷,其经胃肠消化后总花色苷含量降低11.3%。采用体外模拟研究青海黑枸杞功能性组分对肠道功能的作用,发现黑枸杞多糖可延缓葡萄糖的扩散,功能性组分均能抑制α-淀粉酶、胃蛋白酶、胰脂肪酶3种胃肠道主消化酶酶活,具有胆酸盐结合能力。上述结果说明青海黑枸杞多种活性成分可在胃肠中被少量吸收后改善肠道功能。5.为了探究青海黑枸杞功能性组分对肠道健康的影响,利用4%DSS自由饮用方式构建结肠炎模小鼠。进一步对结肠炎小鼠进行黑枸杞功能性组分灌胃处理后,检测小鼠各项病理指标。结果表明,黑枸杞功能性组分(粗多糖、多酚、花色苷)干预能减缓DSS引起的体重骤减、粪便便血、结肠缩短、DAI评分降低等发病症状,改善结肠炎小鼠结肠组织损伤及免疫器官指数上升。Elisa和PCR结果表明,黑枸杞功能性组分可通过降低促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α的水平,有效减轻结肠炎相关炎症反应。同时,功能性组分降低氧化应激标志物MDA(65.89%)、MPO(49.50%)和H2O2(86.20%)的水平,增加抗氧化酶SOD(65.5%)、CAT(79.41%)和GSH-Px(53.44%)的表达,减轻结肠炎相关氧化应激反应。利用16S测序发现,黑枸杞功能性组分有助于恢复结肠炎模型小鼠紊乱的肠道菌群,并提高增加有益菌Lactobacillus、Lachnospira的丰度,减少有害菌Alloprevotella、Parabacteroides。此外,青海黑枸杞功能性组分对肠上皮细胞(IPEC-J2)无显著细胞毒性、小鼠主要器官HE染色无明显病理特征、血常规检测正常。上述结果表明青海黑枸杞功能性组分具有改善炎症性结肠的功能。本研究通过比较不同产地黑枸杞果实代谢差异,结合代谢组与转录组系统研究黑枸杞果实核心差异功能性组分的形成机制,为改良黑枸杞药材品质提供科学依据。进一步借助体外胃肠道消化模拟系统,探究黑枸杞主要功能性组分在胃肠道中的消化吸收模式,结合结肠炎小鼠模型研究黑枸杞功能性组分在体内改善肠道健康的作用机制,为后续深度开发黑枸杞药用及保健功能提供理论依据。