黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)已被国际癌症研究机构评估为已知毒性最强的化学致癌物之一,肝脏是其主要靶器官。此外,胃肠道作为接触霉菌毒素的直接器官,AFB1暴露会损伤其黏膜屏障功能,破坏Biodegradation characteristics肠道菌群结构。肠道菌群的平衡对动物消化吸收、免疫调节等至关重要。因此,维持肠道菌群稳态可能是改善AFB1毒性损伤的潜在途径。中药提取物骨碎补总黄酮(Total flavonoids of Rhizoma Drynariae,TFRD)是从蕨类植物的干燥根茎中提取的天然黄酮类化合物,其对AFB1诱导的肉鸡肝脏损伤具有一定保护作用。因此,本试验旨在探讨AFB1诱导肝脏损伤的作用机制及TFRD的改善作用。本试验以90只1日龄爱拔益加(AA)肉鸡为受试对象,肉鸡适应性饲养3周后,随机分为3组:对照组(CON)、AFB1组、AFB1和TFRD共处理组(A+T)。其中,AFB1组和A+T组嗉囊注射AFB1(100IACS-10759使用方法μg/kg体重,溶于4%乙醇),连续7 d,建立AFB1暴露模型。CON组嗉囊注射等量的4%乙醇,饲喂基础日粮;A+T组肉鸡在基础日粮中添加125 mg/kg的TFRD。探究AFB1对肉鸡肝脏损伤的毒性机制,以及TFRD通过调控肠-肝轴对AFB1诱导的肝损伤的保护作用,主要研究内容与结果如下:(一)探讨TFRD对AFB1暴露肉鸡肠道微生物稳态及肠道屏障的改善作用。对各组肉鸡十二指肠内容物进行16S r RNA测序分析,发现TFRD能够改善AFB1暴露引起的肠道微生物紊乱,且与胆汁酸代谢相关的微生物粪杆菌属(Faecalibacterium)、罕见小球菌属(Subdoligranulum)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、瘤胃球菌属([Ruminococcus])在组间差异显著(p<0.05)。同时,补充TFRD有效改善了十二指肠肠道的形态结构损伤,通过增加隐窝杯状细胞的数目和黏蛋白MUC2的mRNA表达(p<0.05),以及紧密连接蛋白Occludin和Claudin-1的mRNA和蛋白表达水平(p<0.05),从而改善肠道屏障。(二)探讨胆汁酸代谢在AFB1暴露下的参与作用此网站。本试验采集肉鸡血浆样品,利用广泛靶向代谢组学技术,研究不同处理条件下血浆样本之间的代谢产物差异。结合UPLC-MS/MS检测平台、自建数据库和多元统计分析方法,在CON组、AFB1组和A+T组的血浆中共鉴定出773种代谢产物。将鉴定出的代谢物进一步分析,在CON组与AFB1组共筛选出34个显著变化的代谢物,其中有15个上调,19个下调;在AFB1组和A+T组共筛选出57个显著变化的代谢物,其中17个上调,40个下调。KEGG富集分析差异代谢物,发现CON组和AFB1组差异代谢物主要富集在5-羟色胺能突触、花生四烯酸代谢、鞘脂信号通路、脂肪酸生物合成等通路;AFB1组和A+T组差异代谢物主要富集在初级胆汁酸生物合成、亚油酸代谢、胆汁分泌和硫代谢等通路。将CON和AFB1组,AFB1和A+T组间具有显著差异的共同代谢物作为潜在的生物标志物并进行韦恩分析,结果发现有9个共同差异代谢物,包括肌酸、3-N-甲基-L-组氨酸、L-肉碱、刺桐碱、三乙醇胺、L-酪氨酸甲酯4-硫酸盐、牛磺石胆酸、丙氨酸酪氨酸、肉碱C8:0。其中次级胆汁酸牛磺石胆酸在AFB1暴露后呈上升趋势,补充TFRD后显著下降(p<0.05)。另外,刺桐碱的相对含量在AFB1暴露后也显著增加(p<0.001),补充TFRD后显著下降(p<0.001)。提示两者在AFB1暴露肉鸡血浆代谢物中可能发挥解毒作用。此外,通过皮尔逊相关性分析发现差异血浆代谢物与肠道微生物密切相关,如牛磺石胆酸与瘤胃球菌属([Ruminococcus])、乳酸杆菌属(Lactobacillus)呈显著正相关(p<0.05),与罕见小球菌属(Subdoligranulum)呈显著负相关(p<0.05),进一步证明肠道微生物的紊乱影响胆汁酸代谢。(三)探讨TFRD缓解AFB1诱导的肝损伤的分子机制。在以上试验结果基础上,本试验分别检测了抗氧化酶活性水平以及脂质代谢关键调节因子和铁死亡关键基因的mRNA表达水平。首先TFRD有效缓解AFB1诱导的肝脏病理损伤,降低丙氨酸转氨酶(ALT)(p<0.001)和天冬氨酸转氨酶(AST)(p<0.01)活性,增加超氧化物歧化酶(SOD)(p<0.01)、谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)(p<0.01)和过氧化氢酶(CAT)(p<0.05)活性,降低氧化产物丙二醛(MDA)水平(p<0.01),提高抗氧化能力。另外,肝脏油红染色显示AFB1组脂质严重聚积(p<0.001),且血清总胆固醇(TC)(p<0.01)和甘油三酯(TG)(p<0.001)均升高,提示脂质代谢异常,而补充TFRD有效逆转了以上变化。脂质代谢关键调节因子PPARα、CPT-1A、SREBP1和ACC的基因表达在AFB1暴露下均升高(p<0.01),进一步表明AFB1诱导肝脏脂质代谢异常。由于AFB1暴露导致氧化应激及脂质代谢异常,推测肝脏可能发生铁死亡。通过实时荧光定量PCR检测发现AFB1暴露导致铁死亡诱导基因ACSL4的mRNA表达显著上调(p<0.01),铁死亡抑制基因GPX4(p<0.05)和FTH1(p<0.001)的mRNA表达显著下调,这表明AFB1暴露促进肝脏铁死亡,而补充TFRD可有效抑制肝脏铁死亡。随后皮尔逊相关性分析发现血浆代谢物与肝脏脂质代谢基因以及铁死亡相关调节因子均密切相关,提示AFB1通过胃肠道吸收进入血液循环系统,进而对肝脏产生毒性作用。综上所述,TFRD通过改善肠道菌群稳态和肠道屏障功能,纠正脂质和胆汁酸代谢,抑制肝脏氧化应激和铁死亡,对AFB1诱导的肝损伤发挥保护作用。这些发现为研究AFB1诱导的肝脏损伤提供了新的视角,同时为开发改善AFB1肝毒性的中草药饲料添加剂提供理论依据。