研究背景:脑胶质瘤是最常见的颅内原发性肿瘤(50%),其中胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)是一种恶性程度极高的高度侵袭性恶性肿瘤,以病程短、治疗难、预后差为特点。治疗方案以手术切除为主,辅以放化疗。由于解剖特点导致的难以完全切除、血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)的限制、化疗药物靶向性差耐药性高、放疗不敏感性、放化疗副作用多以及肿瘤细胞固有的凋亡抵抗等局限性,即使经过规范化治疗,GBM的中位生存期仅为14.6个月,5年生存率低于10%。因此,亟待开发新型治疗策略以实现胶质瘤的高效治疗,帮助患者延长寿命,提高生存质量。随着纳米科技的渗透与发展,精准医学概念的普及,纳米精准医学为癌症诊治开辟了新的方向与道路。经过合理设计的功能化纳米材料,可以针对内外源性刺激产生特定响应,比如依赖芬顿/类芬顿反应的化学动力治疗(chemodynamic therapy,CDT)、酶/类酶活性催化的活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生、饥饿治疗(starvation therapy,ST)、打破氧化还原稳态、光热治疗((photothermal therapy,PTT)及声动力治疗(sonodynamic therapy,SDT)等,从而实现肿瘤的精准靶向和协同治疗。内源性刺激主要包括过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)、p H值、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、酶等肿瘤微环境(tu获悉更多mor microenvironment,TME)内特异性生化信号;外源性刺激主要包括激光、超声、磁场等外部激发手段。目前,尽管利用内外源刺激响应型功能化纳米材料开展的肿瘤诊疗并不少见,但是针对脑胶质瘤治疗的纳米材料设计还未得到广泛、深入的探索与研究。此外,部分研究通过构建胶质瘤皮下移植瘤模型来评估纳米材料的抑瘤效果,但其与原位脑胶质瘤模型的相似性很难得到保证。基于上述现状,以及纳米精准医学在肿瘤治疗中的良好前景,为满足胶质瘤高效辅助治疗这一重大需求,本研究设计与构建了两种可同时响应内外源性刺激的功能化纳米治疗平台,通过级联反应和协同作用实现了原位脑胶质瘤的高效多模式协同靶向治疗,从而验证了“温和”光热治疗,以及非铁基纳米酶调控肿瘤细胞铁死亡在原位脑胶质瘤治疗中的可行性。研究内容:1.HM-Cu S(TMZ)@HA/GOx-Lf NPs用于原位脑胶质瘤的化学/化学动力/温和光热/饥饿治疗。2.PCN-224@Au/Ce O2-Lf利用其类三酶活性(类葡萄糖氧化酶、类过氧化物酶、类过氧化氢酶)协同声动力疗法用于原位脑胶质瘤的治疗。3.PCN-224@Au/Ce O2-Lf通过激发活性氧爆发、谷胱甘肽消耗,从而导致脂质过氧化物累积,促进肿瘤细胞发生铁死亡。研究目的:本文拟构建两种可靶向原位脑胶质瘤的功能化纳米材料HMCu S(TMZ)@HA/GOx-Lf NPs和PCN-224@Au/Ce O2-Lf,其目的具体有:1.对两种纳米材料进行表征和性能测定,验证其体外及体内水平抑瘤效果和机制。2.验证两种纳米材料靶向胶质瘤细胞及穿透BBB能力。3.验证PCN-224@Au/Ce O2-Lf利用非铁元素诱导肿瘤细胞铁死亡。研究方法:1.通过模板法合成中空介孔硫化铜纳米粒子hollow mesoporous copper sulfide nanoparticles(HM-Cu S NPs),利用其中空多孔结构进一步装载化疗药物替莫唑胺(temozolomide,TMZ),然后包覆以葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOx)和透明质酸(hyaluronic acid,HA)封孔,最后连接乳铁蛋白(lactoferrin,Lf)在外表面,成功构建HM-Cu S(TMZ)@HA/获悉更多GOx-Lf NPs。对其理化性质进行表征,了解其形貌、分子特性,测定纳米材料的药物释放、光热效果、羟基自由基产生、葡萄糖及谷胱甘肽消耗情况,体外行细胞摄取实验、细胞毒性实验和血脑屏障透过能力模拟实验,进一步在细胞和体内水平研究包括光热治疗、类芬顿反应、饥饿治疗、谷胱甘肽消耗在内的抑瘤机制和效果,并分析纳米材料的体内长期毒性等。2.通过简单水热法合成含卟啉的锆基金属有机框架纳米粒子porous coordination network-224 nanoparticles(PCN-224 NPs),原位生长金纳米粒子(Au NPs)后,继续修饰以超小二氧化铈纳米粒子(Ce O2 NPs),随后缠绕牛血清白蛋白(bovine albumin,BSA)提高生物相容性并更改表面电势为负电,最后以静电吸附作用连接Lf,成功构建PCN-224@Au/Ce O2-Lf。对其理化性质进行表征,了解其形貌、分子特性,测定纳米材料的类三酶活性性质(类葡萄糖氧化酶、类过氧化物酶、类过氧化氢酶)、谷胱甘肽消耗以及超声作用下单线态氧产生情况,体外行细胞摄取实验、细胞毒性实验和血脑屏障透过能力模拟实验,进一步在细胞和体内水平研究包括类三酶活性、声动力治疗Biomass allocation、谷胱甘肽消耗在内的抑瘤机制和效果,并分析纳米材料的体内长期毒性等。3.使用多种铁死亡抑制剂验证PCN-224@Au/Ce O2-Lf诱导肿瘤细胞铁死亡,进一步利用生化试剂盒、酶联免疫吸附测定(Elisa)试剂盒、免疫组化等技术在细胞或体内水平评估GSH、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、脂质过氧化物(lipid peroxidation,LPO)以及谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase4,GPX4)的含量和表达。研究结果:1.HM-Cu S(TMZ)@HA/GOx-Lf NPs呈球形,大小均一、分散性好,直径约为60 nm,平均水合粒径约为142 nm,替莫唑胺封装效率约为17.4%,光热及酸性条件下12 h释药率高达70%;在颅骨遮挡的条件下使用808 nm激光照射10 min,温度由28℃升高至44℃,升温效果与纳米材料浓度呈正比,光热性能稳定;NPs消耗葡萄糖产生H2O2和葡萄糖酸;NPs与H2O2发生类芬顿反应产生有毒的羟基自由基(hydroxyl radicals,·OH));NPs能够穿透BBB被肿瘤细胞有效摄取,并产生明显杀伤作用,有效抑制肿瘤生长,而且没有明显的短期及长期毒性。2.PCN-224@Au/Ce O2-Lf呈球形,大小均一、分散性好,直径约为100 nm,平均水合粒径约为154 nm;NPs在超声激发下产生单线态氧(singlet oxygen,1O2);NPs在酸性环境中产生·OH,在中性和弱酸性环境中产生氧气(oxygen,O2);NPs消耗葡萄糖产生H2O2和葡萄糖酸;NPs可以有效降低GSH含量;NPs能够穿透BBB被肿瘤细胞有效摄取,并产生明显杀伤作用,有效抑制肿瘤生长,而且没有明显的短期及长期毒性。3.铁死亡抑制剂可以抑制PCN-224@Au/Ce O2-Lf对肿瘤细胞的杀伤效果;NPs能够下调GSH含量和GPX4表达,提高肿瘤细胞内MDA和LPO水平。研究结论:1.HM-Cu S(TMZ)@HA/GOx-Lf NPs是一种可穿透BBB的智能多刺激响应型金属基功能化纳米材料,实现了级联反应下化学/化学动力/光热/饥饿治疗的高效协同抗胶质瘤作用。Lf赋予纳米材料穿透BBB和靶向胶质瘤细胞的能力。纳米粒子表面修饰HA,不仅可以作为门控防止化疗药物的过早泄露,还可以响应透明质酸酶实现TMZ在肿瘤部位的响应性释放。GOx介导的饥饿治疗可以消耗葡萄糖,提供H2O2和葡萄糖酸,增强材料对肿瘤微环境的响应,加速类芬顿反应发生,从而提高化学动力治疗效果。此外,NPs可以响应808 nm近红外激光照射产生“温和”光热效应(40-44℃)从而实现光热治疗,同时增加Cu2+泄露、加速类芬顿反应进行,以及提高血流速度促进化疗药物的递送。2.在第二个实验中我们构建了可穿透BBB的多刺激响应型非铁基铁死亡诱导型级联纳米酶PCN-224@Au/Ce O2-Lf,并提出了利用非铁元素诱导细胞铁死亡治疗原位脑胶质瘤的概念。超声作用下PCN-224 NPs可以作为声敏剂生成1O2用于肿瘤的声动力治疗,由于其多配位结构还可以作为负载Au和Ce O2纳米粒子的载体,防止其过度聚集。表面原位生长的小尺寸Au NPs具有类GOx活性,可用于饥饿治疗,实现了H2O2的自我补充和更酸性的肿瘤微环境,从而提高了Ce O2的类过氧化物酶活性。由于Ce3+和Ce4+混合价态的存在,超小Ce O2NPs既具有类过氧化物酶(peroxidase,POD)活性,又具有类过氧化氢酶(catalase,CAT)活性,从而实现Ce3+和Ce4+循环中细胞毒性·OH的产生(Ce3+的类POD活性)和O2的释放(Ce4+的类CAT活性)。依赖于Ce4+到Ce3+转化的O2产生既可以增强类POD活性,也可以促进SDT和ST的发生。此外,Ce4+介导的GSH耗竭是促进铁死亡的另一种途径。因此,ROS爆发以及GSH消耗诱导的GPX4失活促进了LPO蓄积,可有效诱导肿瘤细胞铁死亡。最后,外层修饰Lf赋予纳米粒子更好的BBB通透性和肿瘤靶向能力,使其在肿瘤部位最大程度富集。PCN-224@Au/Ce O2-Lf可以通过触发细胞凋亡和铁死亡两种途径共同抑制原位脑胶质瘤生长。非铁元素促进细胞铁死亡的策略在原位脑胶质瘤治疗中具有高度可行性,为未来抗癌纳米平台的设计提供了新方向和新思路。