目的:研究线粒体MICU1在脓毒症获得性肌无力发生发展中的作用及可能的分子机制方法:第一部分购买60只C57/BL 6J小鼠,选取其中40只采用盲肠结扎穿孔术(cecal ligation and puncture,CLP)构建脓毒症模型,随机将小鼠分为4组:(1)假手术组(Sham组,n=8);(2)CLP建模6 h组(CLP-6 h组,n=10);(3)CLP建模12 h组(CLP-12 h组,n=10);(4)CLBafilomycin A1分子量P建模24 h组(CLP-24 h,n=12)。在建模相应时间点检测小鼠四肢抓力(Grip strength)及后肢复合肌动作电位(compound muscle action potential,CMAP)以检测神经肌肉功能;并于小鼠心尖处取血以检测血清中炎症因子白细胞介素6(interleukin,IL-6)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)的placenta infection表达水平;取胫前肌(tibial anterior muscles,TA)通过H&E染色检测肌纤维直径和横截面积(Cross-sectional area,CSA);使用免疫蛋白印迹法(Western blotting,WB)和实时荧光定量PCR法(quantitative realtime PCR,q PCR)检测线粒体钙单转运复合体(mitochondrial calcium uniporter complex,mt CU)各亚基表达水平,包括线粒体钙摄取蛋白1(mitochondrial calcium uptake protein 1,MICU1)、线粒体钙摄取蛋白2(mitochondrial calcium uptake protein 2,MICU2)、线粒体钙单转运体(mitochondrial calcium uniporter,MCU)、基本MCU调节器(essential MCU regulator,EMRE);并检测肌肉萎缩相关蛋白:肌肉特异性环指蛋白1(muscle RING-finger containing protein 1,Mu RF1)、肌肉萎缩F盒蛋白(muscle atrophy F-box protein,MAFbx)的表达水平。另20只SPF级健康雄性小鼠用于腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)胫前肌注射转染,各组小鼠左侧胫前肌空转染24μL AAV作为对照组,标记为AAV-C组;右侧胫前肌转染同等剂量携带MICU1目的基因的AAV提高MICU1表达,标记为AAV-M组。4周后,采用CLP构建脓毒症模型。将小鼠随机分为2组:(1)Sham组(AAV-C-Sham,AAV-M-Sham;n=8),(2)CLP建模24 h组(AAV-C-CLP,AAV-M-CLP;n=12)。检测小鼠抓力及CMAP、肌纤维直径和CSA及MICU1、Mu RF1、MAFbx的表达水平。第二部分将分化5~6 d的C2C12细胞用LPS(5μg/m L)构建细胞脓毒症模型,并随机分为4组:(1)对照组(Control组);(2)LPS建模6 h组(LPS-6 h组);(3)LPS建模12 h组(LPS-12 h组);(4)LPS建模24 h组(LPS-24 h)。于相应时间点,用WB和q PCR方法检测mt CU各蛋白及Mu RF1、MAFbx的表达水平,并用钙离子染料Fluo-4 AM检测细胞质钙离子水平。用携带MICU1目的基因的慢病毒(Lentivirus)转染C2C12细胞以提高MICU1的表达,标记为LV-M组;用空质粒作为阴性对照,标记为LV-C组。实验分为两组:(1)Control组(LV-C-Control,LV-M-Control)及LPS建模24 h组(LVC-LPS,LV-M-LPS)。用WB和q PCR方法检测MICU1及Mu RF1、MAFbx的表达水平,用钙离子染料Fluo-4 AM检测胞质钙离子。结果:第一部分(1)与Sham组相比,CLP组各组小鼠抓力下降(P<0.05)。AAV干预后,与AAV-C-Sham组比较,AAV-M-Sham组小鼠各项指标差异无统计学意义(P>0.05),AAV-C-CLP组小鼠抓力下降(P<0.05);与AAV-C-CLP组比较,AAV-M-CLP组小鼠抓力增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)与Sham组相比,CLP组各组小鼠CMAP峰值下降,持续时间延长,潜伏期延长(P<0.05)。与AAV-C-Sham组比较,AAVM-Sham组小鼠各项指标差异无统计学意义(P>0.05),AAV-C-CLP组小鼠CMAP峰值下降,持续时间延长,潜伏期延长(P<0.05);与AAV-C-CLP组比较,AAV-M-CLP组小鼠CMAP峰值增高,持续时间缩短,潜伏期缩短,差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)与Sham组相比,CLP组各组小鼠骨骼肌肌纤维直径和CSA下降(P<0.05)。AAV预后,与AAV-C-Sham组比较,AAV-MSham组小鼠各项指标差异无统计学意义(P>0.05),AAV-C-CLP组小鼠骨骼肌肌纤维直径和CSA下降(P<0.05),AAV-M-CLP组小鼠骨骼肌肌纤维CSA下降(P<0.05);与AAV-C-CLP组比较,AAVM-CLP组小鼠骨骼肌肌纤维直径和CSA增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。(4)与Sham组相比,CLP-12 h组和CLP-24 h组小鼠肌肉萎缩相关蛋白Mu 获悉更多RF1、MAFbx蛋白和基因表达水平升高(P<0.05)。AAV干预后,与AAV-C-Sham组比较,AAV-M-Sham组小鼠各项指标差异无统计学意义(P>0.05),AAV-C-CLP组和AAC-M-CLP组小鼠肌肉萎缩相关蛋白Mu RF1、MAFbx蛋白及基因表达水平增高(P<0.05);与AAV-C-CLP组比较,AAV-M-CLP组小鼠肌肉萎缩相关蛋白Mu RF1、MAFbx蛋白及基因表达水平下降,差异有统计学意义(P<0.05)。(5)在蛋白表达层面,与Sham组相比,CLP-24 h组小鼠骨骼肌线粒体MICU1、MICU2蛋白表达水平下降(P<0.05),CLP组各组小鼠骨骼肌线粒体MCU蛋白表达水平升高(P<0.05);在基因表达层面,与Sham组相比,CLP-24 h组小鼠胫前肌线粒体MICU1、MICU2基因表达水平下降(P<0.05),CLP-12 h组、CLP-24 h组小鼠胫前肌线粒体MCU基因表达水平升高(P<0.05)。线粒体EMRE的表达水平在蛋白和基因层面各项指标无统计学差异(P>0.05)。(6)在蛋白表达层面,与Sham组相比,CLP组各组小鼠肌肉MICU1/MCU蛋白表达水平下降(P<0.05);在基因表达层面,与Sham组相比,CLP-24 h组小鼠肌肉MICU1/MCU基因表达水平下降,差异有统计学意义(P<0.05)。第二部分(1)在蛋白表达层面,与Control组相比,LPS组各组萎缩相关蛋白Mu RF1、MAFbx表达水平增高(P<0.05);在基因转录水平,与Control组相比,LPS-12 h和LPS-24 h组的Mu RF1的表达及LPS-24 h组的MAFbx表达水平增高(P<0.05)。慢病毒转染C2C12细胞后,在蛋白表达层面,与LV-C-Control组相比,LV-M-Control组的各项指标差异无统计学意义(P>0.05),LV-C-LPS组和LV-M-LPS组的萎缩蛋白Mu RF1、MAFbx的表达水平增高(P<0.05);与LVC-LPS组相比,LV-M-LPS组萎缩蛋白Mu RF1、MAFbx的表达水平降低(P<0.05)。在基因表达层面,与LV-C-Control组相比,LV-MControl组的各项指标差异无统计学意义(P>0.05),LV-C-LPS组的骨骼肌Mu RF1、MAFbx的表达水平增高(P<0.05);与LV-C-LPS组相比,LV-M-LPS组的萎缩蛋白Mu RF1、MAFbx的基因表达水平降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)在蛋白表达层面,与Control组相比,LPS-12 h组和LPS-24 h组细胞线粒体MICU1、MICU2蛋白水平下降(P<0.05),LPS-24 h组细胞线粒体MCU蛋白表达水平升高(P<0.05);在基因转录水平,与Control组相比,LPS-12 h组与LPS-24 h组的MICU1基因表达及LPS-24 h组的MICU2基因表达水平下降(P<0.05),LPS-24h组的MCU基因表达水平升高(P<0.05)。线粒体EMRE的表达水平在蛋白和基因层面各项指标无统计学差异(P>0.05)。(3)在蛋白表达层面,与Control组相比,LPS组各组细胞MICU1/MCU蛋白表达水平下降(P<0.05);在基因转录水平,与Control组相比,LPS-24 h组的MICU1/MCU表达水平下降,并具有统计学差异(P<0.05)。(4)当2.5μM钙离子加入时,与Control组相比,LPS组各组细胞线粒体钙离子释放速率增加(P<0.05);当20μM钙离子加入时,与Control组相比,LPS-24 h组细胞线粒体钙离子释放速率降低(P<0.05)。C2C12细胞在LPS干预后,萎缩蛋白Mu RF1的表达水平与线粒体钙离子具有相关性,相关系数R=0.8086。慢病毒转染C2C12细胞后,当2.5μM钙离子加入时,与LV-C-Control组相比,LV-M-Control组的各项指标无统计学差异(P>0.05),LV-C-LPS组细胞线粒体钙离子释放速率增加(P<0.05);与LV-C-LPS组相比,LV-M-LPS组细胞线粒体钙离子释放率降低(P<0.05)。当20μM钙离子加入时,与LV-C-Control组相比,LV-M-Control组的各项指标差异无统计学意义(P>0.05),LV-C-LPS组细胞线粒体钙离子释放速率降低(P<0.05);与LV-C-LPS组相比,LV-M-LPS组细胞线粒体钙离子释放率增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:(1)脓毒症通过降低小鼠和C2C12细胞MICU1/MCU的表达水平,引起静息状态下线粒体钙超载,导致骨骼肌功能障碍;(2)LPS导致C2C12细胞线粒体在静息状态下发生钙超载;当胞质钙离子浓度超过线粒体钙离子摄取阈值时,MICU1失去与MICU2的协同激活作用,导致线粒体钙离子摄取障碍;(3)外源性提高MICU1的表达,通过调节线粒体钙离子摄取紊乱的情况,最终改善由脓毒症导致的骨骼肌功能障碍和肌纤维萎缩。